カルボヒドラ-ゼの基質認識と反応機構の解析

糖酶的底物识别及反应机制分析

• 批准号: 03236204
• 负责人: 千葉 誠哉
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03236204/
• 关键词: βーアミラ-ゼ; マルタ-ル; アイソト-プ効果; αーグルコシダ-ゼ; 水和反応

(1)サツマイモおよびダイズのβーアミラ-ゼを二重結合を有する特殊基質、maltalに作用させ、生成する2ーdeoxymaltoseのアノマ-型をGLC法を用いて調べた。両酵素ともβーアノマ-を生成していることが明らかになった。次に、基質二重結合の付加方向を ^1HーNMRを用いて決定した。酵素反応をD_2O中で行い、生成する2ーdeoxyー[2ー ^2H]maltoseの ^1HーNMR解析から、両酵素はシス方向から二重結合を水和することが判明した。これまで、解明された多くの酵素的水和反応はすべてトランス付加であり、βーアミラ-ゼはシス付加を行う初めての酵素である。D_2O中で行った速度論的解析から、この酵素的水和反応は著しいアイソト-プ効果(V_H/V_D=6.5)を示した。(2)Aspergillus niger αーグルコシダ-ゼの全一次構造をエドマン法を用いて決定した。本酵素は2つのサブユニット(P1およびP2と略称、分子量はそれぞれ約3.5×10^4および約9.8×10^4)から構成されている。還元ピリジルエチル化後、HPLCで分離精製したP1およびP2をリジルエンドペプチダ-ゼで消化した。得られた各ペプチド(LYペプチドと略称)をさらに各種プロテア-ゼおよびBrCN処理により断片化した。各ペプチド断片は気相シ-クエンサ-を用いて配列解析し、全てのLYペプチドのアミノ酸配列を明らかにした。各LYペプチドの連結はP1およびP2を再びAspーNプロテア-ゼやV8プロテア-ゼ消化あるいはAspーPro結合の化学的切断により、得られたペプチドを用いて行い、P1およびP2サブユニットの全一次構造を決定した。その結果、P1は227個の、P2は719個のアミノ酸残基から構成されていることが明らかになった。

(1)サツマイモおよびダイズのβーアミラ-ゼをDouble combination を有する special matrix, maltalに Effect させ、Generate する2ーdeoxymaltoseのアノマ-type をGLC method を Use いて to adjust べた.両Enzyme ともβーアノマ-をGeneration していることが明らかになった. The direction of the secondary and matrix double binding is determined by ^1H NMR. Enzyme reacts with D_2O in で行い, generates する2ーdeoxyー[2ー^2H]maltoseの^1HーNMR analysis revealed the direction of the enzyme and the double binding of water and enzyme.これまで, clarified された多くのenzyme water and reaction はすべてトランスPay Add であり, βーアミラ-ゼはシスpay add を行う初めてのzyme である. The analysis of the speed theory of で行った in D_2O, the water of このenzyme and the reaction しいアイソト-プ effect (V_H/V_D=6.5) are shown. (2) Aspergillus niger αーグルコシダ-ゼのall-once constructionをエドマン法を用いてdetermineした. The abbreviation of this enzyme is は2つのサブユニット(P1およびP2と, molecular weight はそれぞれabout 3.5×10^4およびabout 9.8×10^4)から constitutes されている. After returning to the original ピリジルエチル, HPLC separated and purified the したP1 およびP2 をリジルエンドペプチダ-ゼでdigested した. It is a られたペプチド(LYペプチドとabbreviation) をさらにvarious プロテア-ゼおよびBrCN processed により fragmentation した. Each ペプチド fragment has a は気phase シ-クエンサ-を いて arrangement analysis し, and a full てのLY ペプチドのアミノ acid arrangement を明らかにした. Each LYペプチドのconnectionはP1およびP2を ZaiびAspーNプロテア-ゼやV8プロテア-ゼDigestionあるいはAspーPr oChemical cutting of the combination, the cutting of the られたペプチドを and the いて行い, the P1 およびP2 サブユニットのall-once structure をdetermination した. As a result, P1 has 227 residues, and P2 has 719 residues of acid residues.

项目成果

S.Kitahata: "Mechanism of Maltal Hydration Catalyzed by βーAmylase:Role of Protein Structure in Controlling the Steric Outcome of Reaction Catalyzed by a Glycosylase" Biochemistry. 30. 6769-6775 (1991)

S. Kitahata：“β-淀粉酶催化的麦芽糖水合机制：蛋白质结构在控制糖基化酶催化反应的空间结果中的作用”生物化学 30. 6769-6775 (1991)。

H.Mori: "Nucleotide and derived amino acid sequence of a catalase cDNA isolated from rice immature seeds" Plant Mol.Biol. 18. (1992)

H.Mori：“从水稻未成熟种子中分离的过氧化氢酶 cDNA 的核苷酸和衍生氨基酸序列”Plant Mol.Biol。

N.Shimomura: "Cysteinーconjugate βーlyase from Mucor javanicus" Biosci.Biotech.Biochem.58. (1992)

N.Shimomura：“来自爪哇毛霉的半胱氨酸结合 β-裂解酶”Biosci.Biotech.Biochem.58 (1992)。

松井 博和: "アイソト-プ効果によるエキソーαーグルカナ-ゼの反応機構の解析" 澱粉科学. 38. 181-185 (1991)

Hirokazu Matsui：“通过同位素效应分析外切-α-葡聚糖酶的反应机制”《淀粉科学》38. 181-185 (1991)。