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ポリオウイルス特異的蛋白合成開始機構に関わる宿主因子の解析

脊髓灰质炎病毒特异性蛋白质合成起始机制涉及的宿主因素分析

基本信息

批准号：
04271207
负责人：
豊田春香
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04271207/
关键词：
ポリオウイルス蛋白質合成内部認識機構宿主因子

项目摘要

(1)アッセイ系の確立;HeLa細胞中に存在するポリオウイルス(PV)mRNAの翻訳開始に必須の宿主因子を分離・同定するためのアッセイ系の確立を行った。そのため本来PVRNAの翻訳効率を極めて悪いウサギ網状赤血球の粗抽出液(RRL)を利用したin vitro系を用いて、反応温度、時間、並びに反応系に添加するHeLa細胞抽出液量や鋳型RNA量についてその至適条件を検討した。その結果、HeLa細胞抽出液を加えることで、PVRNA特異的に翻訳効率の促進が観察されるようなアッセイ系を確立することに成功した。またこの翻訳促進活性は、HeLa細胞抽出液中のリボソームにアソシエートした蛋白質画分(RSW)に最も高い割合で存在していることが明らかとなった。(2)活性成分の部分精製;RSW画分についてSephacryl S-300カラムを用いてゲルろ過を行った結果、活性のピークは分子量マーカー240,000の蛋白質よりもさらに高分子量側に溶出することが明らかとなった。次にこの活性画分についてDEAE-Sephacelによるイオン交換クロマトグラフィーを行ったが、塩化カリウムの濃度を変えて溶出させたどの画分にも翻訳促進活性は見いだせず、またそれぞれの画分を足し合わせて添加した場合でも活性は認められなかった。さらに数種のアフィニティーカラムを用いてその部分精製を試みたところ、翻訳促進活性はこのうちHydroxyapatiteのみに親和性を示し、150mMのリン酸カリウムを含む緩衝液により溶出させてくることが判明した。この活性画分を再びゲルろ過法により分析したところ、活性はやはり240,000以上の高分子量を保持していることが確認された。

(1)Establishment of the cell line; isolation and identification of the host factors necessary for the initiation of transcription of the protein (PV)mRNA in HeLa cells To investigate the optimal conditions for the conversion efficiency of PVRNA and the utilization of crude reticulocyte extract (RRL) in vitro system, temperature, time, and addition of RRL to HeLa cell extract and amount of RRL. The results showed that the expression of PVRNA in HeLa cell extract was significantly higher than that in the control group. The activity of this enzyme was enhanced by the presence of a protein fragment (RSW) in HeLa cell extracts. (2)Part of the active ingredient is purified;RSW is divided into three parts: Sephacryl S-300, Sephacryl S-300, Sephacryl S-300 and Sephacryl S-300. In addition, the activity of DEAE-Sephacel can be increased by increasing the concentration of DEAE-Sephacel, increasing the concentration of DEAE-Sephacel, and increasing the activity of DEAE-Sephacel. The activity of several kinds of hydroxyapatites was tested by partial purification, and the affinity of hydroxyapatites was shown by 150mM hydrochloric acid buffer solution. The activity of this enzyme is determined by the method of analysis. The activity of this enzyme is higher than 240,000 and the high molecular weight is maintained.