ポリオウイルス特異的蛋白合成開始機構に関わる宿主因子の解析

(1)アッセイ系の確立;HeLa細胞中に存在するポリオウイルス(PV)mRNAの翻訳開始に必須の宿主因子を分離・同定するためのアッセイ系の確立を行った。そのため本来PVRNAの翻訳効率を極めて悪いウサギ網状赤血球の粗抽出液(RRL)を利用したin vitro系を用いて、反応温度、時間、並びに反応系に添加するHeLa細胞抽出液量や鋳型RNA量についてその至適条件を検討した。その結果、HeLa細胞抽出液を加えることで、PVRNA特異的に翻訳効率の促進が観察されるようなアッセイ系を確立することに成功した。またこの翻訳促進活性は、HeLa細胞抽出液中のリボソームにアソシエートした蛋白質画分(RSW)に最も高い割合で存在していることが明らかとなった。(2)活性成分の部分精製;RSW画分についてSephacryl S-300カラムを用いてゲルろ過を行った結果、活性のピークは分子量マーカー240,000の蛋白質よりもさらに高分子量側に溶出することが明らかとなった。次にこの活性画分についてDEAE-Sephacelによるイオン交換クロマトグラフィーを行ったが、塩化カリウムの濃度を変えて溶出させたどの画分にも翻訳促進活性は見いだせず、またそれぞれの画分を足し合わせて添加した場合でも活性は認められなかった。さらに数種のアフィニティーカラムを用いてその部分精製を試みたところ、翻訳促進活性はこのうちHydroxyapatiteのみに親和性を示し、150mMのリン酸カリウムを含む緩衝液により溶出させてくることが判明した。この活性画分を再びゲルろ過法により分析したところ、活性はやはり240,000以上の高分子量を保持していることが確認された。

(1)アッセイ系の確立;HeLa細胞中に存在するポリオウイルス(PV)mRNAの翻訳開始に必須の宿主因子を分離・同定するためのアッセイ系の確立を行った。そのため本来PVRNAの翻訳効率を極めて悪いウサギ網状赤血球の粗抽出液(RRL)を利用したin vitro系を用いて、反応温度、時間、並びに反応系に添加するHeLa細胞抽出液量や鋳型RNA量についてその至適条件を検討した。その結果、HeLa細胞抽出液を加えることで、PVRNA特異的に翻訳効率の促進が観察されるようなアッセイ系を確立することに成功した。またこの翻訳促進活性は、HeLa細胞抽出液中のリボソームにアソシエートした蛋白質画分(RSW)に最も高い割合で存在していることが明らかとなった。(2)活性成分の部分精製;RSW画分についてSephacryl S-300カラムを用いてゲルろ過を行った結果、活性のピークは分子量マーカー240,000の蛋白質よりもさらに高分子量側に溶出することが明らかとなった。次にこの活性画分についてDEAE-Sephacelによるイオン交換クロマトグラフィーを行ったが、塩化カリウムの濃度を変えて溶出させたどの画分にも翻訳促進活性は見いだせず、またそれぞれの画分を足し合わせて添加した場合でも活性は認められなかった。さらに数種のアフィニティーカラムを用いてその部分精製を試みたところ、翻訳促進活性はこのうちHydroxyapatiteのみに親和性を示し、150mMのリン酸カリウムを含む緩衝液により溶出させてくることが判明した。この活性画分を再びゲルろ過法により分析したところ、活性はやはり240,000以上の高分子量を保持していることが確認された。