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C型肝炎ウイルスのIRES機能

丙型肝炎病毒的IRES功能

基本信息

批准号：
09253207
负责人：
豊田春香
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1) ジシストロニックmRNA構造をもつcDNAの作成:HCVIRESとして遺伝子型1bおよび2bRNAの5'末端から、それに続くコア蛋白の69塩基までのRNA領域を使用した。第1シストロンにCAP依存的に翻訳されるCATmRNA、第2シストロンにはHCVIRES依存的に翻訳されるように設計したβ-gal mRNAをもつジシストロニックmRNAのcDNAを作製した。このジシストロニックmRNAの発現がCAGプロモーターによりコントロール可能なプラスミドを構築し、HeLa細胞にトランスフェクション法により導入したところCAT及びβ-gal両活性が検出された。(2) 組換え体アデノウイルスの作製:このmRNAの発現系としてアデノウイルスベクター(Adex1w)を利用した。遺伝子型1b,2bともにそれらIRESをもつ組み換えアデノウイルスを作製することが出来た。(3) 培養細胞におけるレポーター遺伝子発現量の測定:培養栽培として、HeLa,AGMK,HepG2細胞を用いた。これら細胞に上記組換え体アデノウイルスを感染させたところ、CATおよびβーガラクトシターゼの両酵素活性を検出することが出来た。この酵素活性はウイルスの感染価に伴って変化し、また感染時間によっても変化した。このような結果は、CAT活性に対する相対的なβ-gal活性を比較することで各種IRES活性の比較を行える可能性を示している。さらにHeLa細胞においては、換えアデノウイルス感染後の個々の細胞におけるレポーター遺伝子(CAT及びβ-gal)の発現量を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて定量化する系を確立した。

(1)The construction of cDNA for HCVIRES mRNA is based on the use of the RNA domain of HCVIRES gene type 1b and 2b RNA at the 5'end and the 69' end of HCVIRES gene type 69. The first CAP-dependent gene is CAT mRNA, the second CAP-dependent gene is HCVIRES-dependent gene, and the third CAP-dependent gene is cDNA. The expression of this gene is related to CAG gene expression, and the expression of CAT and β-gal activity is related to the construction of HeLa cells. (2)The expression of this mRNA is mainly due to the use of Adex 1w. For example, if you have a child type 1b,2b, you can use it as a control. (3)Determination of the amount of gene production in cultured cells: Cultured cells, HeLa,AGMK, HepG2 cells were used. The cells were identified by enzyme activity and CAT activity. The enzyme activity of the virus changes with the time of infection. The results show the possibility of comparing the activities of CAT and β-gal. The detection of CAT and β-gal in HeLa cells was quantified by confocal microscopy.