ポリオウイルスRNA複製に関与するウイルス特異的蛋白質の解析

参与脊髓灰质炎病毒 RNA 复制的病毒特异性蛋白分析

• 批准号: 05770216
• 负责人: 豊田 春香
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770216/
• 关键词: ポリオウイルス; RNA複製; ヘリカーゼ

ポリオウイルス遺伝子RNAがコードするウイルス非構造蛋白質のうち、分子量38kDaの2C蛋白質はポリオウイルスRNAの合成に関与する蛋白質であると古くから考えられていたが、その明確な機能については未だ明らかにされていない。最近そのアミノ酸配列の比較から、ヘリカーゼ活性を有する可能性が示唆されている。そこで本研究ではポリオウイルス2C蛋白質を大腸菌内で大量に発現させたのち分離精製し、これを用いてin vitroにおけるヘリ-カゼ活性の有無について検討することを目的とした。そこでまず、ポリオウイルス2C蛋白質がグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として発現するように構築させたcDNAをtacプロモーターの下流に連結したrecombinantDNAを作製した。これを用いて大腸菌内でGST-2C融合蛋白質を大量に発現させることに成功した。しかしながら、グルタチオンセファロースビーズによる部分精製を進めるにあたって、この融合蛋白質が非常に可溶化しにくい性質を示すことが明らかとなった。すなわち、菌体抽出液を1%TweenX-100,1%TweenX-20あるいは0.03%SDS等の界面活性在で処理しても、また塩濃度を0.3MNaClにまで高めてもその95%以上は膜画分に存在したままであった。可溶化した極く微量の融合蛋白質から、トロンビン処理により2C蛋白質部分をGST部分から切り離し精製した。これについてstrand replacementアッセイによりヘリカーゼ活性の有無を検討したが活性は認められなかった。このことは、可溶化段階で2C蛋白質が変性してしまったことを反映した結果とも考えられさらなる検討が必要と思われる。

A 38kDa 2C protein is involved in the synthesis of RNA. A protein that has a specific function is a non-structural protein. Recent comparisons of acid sequences show that there is a possibility of a change in activity. The aim of this study is to isolate and purify large amounts of 2C protein in Escherichia coli and to use it in vitro. The fusion protein of GST and cDNA was constructed and recombinantDNA was produced. The GST-2C fusion protein was successfully expressed in large quantities in E. coli. The fusion protein is very soluble and its properties are shown clearly. The interfacial activity of 1%TweenX-100, 1%TweenX-20, 0.03%SDS and so on was higher than 95% when the concentration of TweenX-100, 1%TweenX-20 was 0.3M NaCl. The fusion protein was dissolved in a very small amount, and the GST part was isolated and purified. This is the first time I've ever seen a person who's been in a situation where I've been in a The 2C protein in the soluble phase is not soluble.