ポリオウイルスRNA複製に関与するウイルス特異的蛋白質の解析

ポリオウイルス遺伝子RNAがコードするウイルス非構造蛋白質のうち、分子量38kDaの2C蛋白質はポリオウイルスRNAの合成に関与する蛋白質であると古くから考えられていたが、その明確な機能については未だ明らかにされていない。最近そのアミノ酸配列の比較から、ヘリカーゼ活性を有する可能性が示唆されている。そこで本研究ではポリオウイルス2C蛋白質を大腸菌内で大量に発現させたのち分離精製し、これを用いてin vitroにおけるヘリ-カゼ活性の有無について検討することを目的とした。そこでまず、ポリオウイルス2C蛋白質がグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として発現するように構築させたcDNAをtacプロモーターの下流に連結したrecombinantDNAを作製した。これを用いて大腸菌内でGST-2C融合蛋白質を大量に発現させることに成功した。しかしながら、グルタチオンセファロースビーズによる部分精製を進めるにあたって、この融合蛋白質が非常に可溶化しにくい性質を示すことが明らかとなった。すなわち、菌体抽出液を1%TweenX-100,1%TweenX-20あるいは0.03%SDS等の界面活性在で処理しても、また塩濃度を0.3MNaClにまで高めてもその95%以上は膜画分に存在したままであった。可溶化した極く微量の融合蛋白質から、トロンビン処理により2C蛋白質部分をGST部分から切り離し精製した。これについてstrand replacementアッセイによりヘリカーゼ活性の有無を検討したが活性は認められなかった。このことは、可溶化段階で2C蛋白質が変性してしまったことを反映した結果とも考えられさらなる検討が必要と思われる。

ポリオウイルス遺伝子RNAがコードするウイルス非構造蛋白質のうち、分子量38kDaの2C蛋白質はポリオウイルスRNAの合成に関与する蛋白質であると古くから考えられていたが、その明確な機能については未だ明らかにされていない。最近そのアミノ酸配列の比較から、ヘリカーゼ活性を有する可能性が示唆されている。そこで本研究ではポリオウイルス2C蛋白質を大腸菌内で大量に発現させたのち分離精製し、これを用いてin vitroにおけるヘリ-カゼ活性の有無について検討することを目的とした。そこでまず、ポリオウイルス2C蛋白質がグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として発現するように構築させたcDNAをtacプロモーターの下流に連結したrecombinantDNAを作製した。これを用いて大腸菌内でGST-2C融合蛋白質を大量に発現させることに成功した。しかしながら、グルタチオンセファロースビーズによる部分精製を進めるにあたって、この融合蛋白質が非常に可溶化しにくい性質を示すことが明らかとなった。すなわち、菌体抽出液を1%TweenX-100,1%TweenX-20あるいは0.03%SDS等の界面活性在で処理しても、また塩濃度を0.3MNaClにまで高めてもその95%以上は膜画分に存在したままであった。可溶化した極く微量の融合蛋白質から、トロンビン処理により2C蛋白質部分をGST部分から切り離し精製した。これについてstrand replacementアッセイによりヘリカーゼ活性の有無を検討したが活性は認められなかった。このことは、可溶化段階で2C蛋白質が変性してしまったことを反映した結果とも考えられさらなる検討が必要と思われる。