光による葉緑体遺伝子の転写制御機構

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本年度は、光による葉緑体遺伝子の転写誘導が核にコードされた転写制御因子によってどの様に制御されているかを明らかにするために、1.in vivoで見られる光による転写活性変化を再現できる葉緑体in vitro転写系の改良、2.光誘導転写に関わるシス因子の同定、3.光誘導転写制御因子の部分精製を行った。1.葉緑体in vitro転写系の改良光照射前後のコムギのプラスチドの膜画分を高塩濃度緩衝液で処理しin vitro転写活性を有したプラスチド抽出液を調製した。抽出処理の改良によりin vivoでの転写誘導のin vitroでの再現性を高めることが出来た。葉緑体psbD/C遺伝子クラスターの構成的転写開始点のプロモーター(D/C-2、-4)による転写は光照射前後のどちらのプラスチドからの抽出液でも同程度の活性であったが、光誘導プロモーター(D/C-3)の転写活性は光照射後のプラスチド抽出液で著しく促進されていた。この成果は現在Physiologyに投稿中である。また、TritonX-100を使用することにより、前者の約5倍の転写活性を持つ葉緑体抽出液を調製することにも成功した。2.in vitro転写系を用いた光誘導シス因子の同定光誘導プロモーター(D/C-3)と構成的プロモーター(D/C-4)の上流配列を順次欠失させた鋳型DNAを用いてin vitro転写を行い、D/C-3プロモーターからの光誘導転写に関与するシス因子の同定を行った。構成的転写開始点D/C-4のプロモーターは多くの葉緑体プロモーターと同様に原核生物タイプであるのに対して、光誘導転写に関わるシス因子は、D/C-3の転写開始点の150bp以上上流にあることが分かった。従って、光誘導プロモーターは構成的なプロモーターとは異なった特異的なシス因子によって制御されていると考えられる。3.光誘導転写制御因子の部分精製先に述べたTritonX-100による葉緑体抽出液をヘパリン-sepharoseカラムで分画し、RNAポリメラーゼ活性を有する画分は光誘導転写制御因子を含む画分を分離することが出来、両者を再構成することにより光誘導プロモーターからの転写が再現された。