ラット肝セリンアミノ転移酵素の細胞内二重局在を規定する分子機構

调控大鼠肝丝氨酸转氨酶细胞内双重定位的分子机制

基本信息

批准号：
05252214
负责人：
小田敏明
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05252214/
关键词：
セリンアミノ転移酵素オルガネラ局在化機構転写調節

项目摘要

(1)ミトコンドリア(Mt)移行配列の長さとSPTの高次構造、活性との関係種々の長さのMt移行配列(MTS)を持つSPT前駆体の大腸菌体内発現組み換え体を作製し、発現された蛋白質の量、酵素の比活性の比較を行った。用いた組み換え体はpRspt1AA(完全なSPTm前駆体をコード),pRspt3AA(β-GalのN末端7アミノ酸にSPTm前駆体のArg(3)以降の配列が結合した融合蛋白質をコード),pRspt11AA(β-GalのN末端8アミノ酸にSPTm前駆体のThr(11)以降の配列が結合),pRspt10(β-GalのN末端7アミノ酸にSPTm前駆体のAsn(22)以降の配列が結合)の4種である。MTSを含む融合蛋白質は成熟型SPTと同程度の比活性を持っていたが、MTSを多く含むほど発現量が少ない、すなわち蛋白質として不安定であることがわかった。完全なSPTm前駆体をコードしたクローン,pRspt1AAでは蛋白質、活性いずれもまったく発現が見られなかった。また無細胞翻訳系で合成した前駆体SPTと成熟型SPTをProteinase K消化したところ、前駆体が優先的に消化された。これらの結果はMTSの存在がSPT酵素分子の高次構造に大きな影響を与えていること、いいかえればMTSの存在によりSPTがプロテアーゼに対し高感受性のほぐれた状態になることを示唆している。(2)転写開始位置の決定機構の解析典型的なTATA Boxを持たない下流のプロモーター(+66より転写)の最小機能配列を推定するために、解析する組換え体のSPT遺伝子プロモーターの3'側は+105に固定し、5'上流からの順次欠失組換え体を作製した。プロモーター活性は+36〜+105でも見られたが、-52〜+105で最大活性を示した。+9〜+105にはTATA-lessプロモーターの一つとして提唱されているHIP1(Housekeeping initiator protein1)の結合するコンセンサス配列、ATTTCN(1-30)GCCAが存在しているが、-52〜+105まで含まないと最大活性が出ないことよりHIP1配列のみでは下流プロモーターの至適活性の発揮には不十分であると考えられた。一方、上流からの転写は-194〜+36で最大となるので、-107〜+36に含まれるCCAAT Box,TATA Box以外に-107〜-194に含まれる別のエレメントが最大活性を出すために必要であろうと推論された。また上流のプロモーターの活性は下流のプロモーターの活性の1/10以下であることが明らかとなり、これは未処理ラット肝のRNAブロット解析で得られた結果と一致する。

（1）线粒体（MT）过渡序列的长度与SPT的高阶结构和活性之间的关系。在大肠杆菌中表达的重组剂是由具有各种长度的MT过渡序列（MT）的SPT前体制备的，并比较了酶的表达蛋白质和特异性活性。 The recombinants used were four types: pRspt1AA (encoding the complete SPTm precursor), pRspt3AA (encoding a fusion protein in which the sequence of Arg(3) and subsequent SPTm precursor is bound to the N-terminal 7 amino acids of β-Gal), pRspt11AA (constituted by the N-terminal 8 amino acids of β-Gal are bound to the β-GAL的N末端8氨基酸和PRSPT10（由ASN（22）和随后的SPTM前体构成与β-GAL的N末端7氨基酸结合）。含有MT的融合蛋白具有与成熟SPT相似的特异性活性，但发现含有MT的含量越多，含量越少，即蛋白质越不稳定。在编码完整的SPTM前体的克隆PRSPT1AA中未观察到蛋白质或活性的表达。此外，当蛋白酶K用前体SPT消化并使用无细胞翻译系统合成成熟的SPT时，优先消化了前体。这些结果表明，MT的存在对SPT酶分子的结构具有显着影响，换句话说，MTS的存在使SPT对蛋白酶高度敏感。（2）分析确定转录启动位置的机制，以估计没有典型的TATA盒的下游启动子的最小功能序列（+66的转录），重组的SPT基因启动子的3'侧被固定为+105，并从+105固定，并从+105中固定了序列删除，并从上sequeTiens deletion retetion reetion sefient sefient sefient sefient sefient rebodears is of postrears inspream inspream inspream inspreats ststream。在+36-+105时也可以看到启动子活性，但在-52-+105时显示出最大的活性。 ATTTCN（1-30）GCCA，与HIP1结合的共识序列（管家引发剂蛋白1），已被提出是无TATA的启动子之一，以+9至+105的形式存在，但最大程度的活性无法在不包含-52至+105的情况下实现最大的活性，因此可以单独使用HIP1序列，因此可以无效地启动。另一方面，由于从上游的转录是-194和+36之间的最大值，因此可以推断出，除了-107和+36中包含的CCAAT盒和TATA框之外，还需要在-107和-194中包含的另一个元素来产生最大活动。还表明，上游启动子的活性小于下游启动子活性的1/10，这与未经处理的大鼠肝脏RNA印迹分析获得的结果一致。