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ラット肝セリンアミノ転移酵素の細胞内二重局在を規定する分子機構

调控大鼠肝丝氨酸转氨酶细胞内双重定位的分子机制

基本信息

批准号：
05252214
负责人：
小田敏明
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05252214/
关键词：
セリンアミノ転移酵素オルガネラ局在化機構転写調節

项目摘要

(1)ミトコンドリア(Mt)移行配列の長さとSPTの高次構造、活性との関係種々の長さのMt移行配列(MTS)を持つSPT前駆体の大腸菌体内発現組み換え体を作製し、発現された蛋白質の量、酵素の比活性の比較を行った。用いた組み換え体はpRspt1AA(完全なSPTm前駆体をコード),pRspt3AA(β-GalのN末端7アミノ酸にSPTm前駆体のArg(3)以降の配列が結合した融合蛋白質をコード),pRspt11AA(β-GalのN末端8アミノ酸にSPTm前駆体のThr(11)以降の配列が結合),pRspt10(β-GalのN末端7アミノ酸にSPTm前駆体のAsn(22)以降の配列が結合)の4種である。MTSを含む融合蛋白質は成熟型SPTと同程度の比活性を持っていたが、MTSを多く含むほど発現量が少ない、すなわち蛋白質として不安定であることがわかった。完全なSPTm前駆体をコードしたクローン,pRspt1AAでは蛋白質、活性いずれもまったく発現が見られなかった。また無細胞翻訳系で合成した前駆体SPTと成熟型SPTをProteinase K消化したところ、前駆体が優先的に消化された。これらの結果はMTSの存在がSPT酵素分子の高次構造に大きな影響を与えていること、いいかえればMTSの存在によりSPTがプロテアーゼに対し高感受性のほぐれた状態になることを示唆している。(2)転写開始位置の決定機構の解析典型的なTATA Boxを持たない下流のプロモーター(+66より転写)の最小機能配列を推定するために、解析する組換え体のSPT遺伝子プロモーターの3'側は+105に固定し、5'上流からの順次欠失組換え体を作製した。プロモーター活性は+36〜+105でも見られたが、-52〜+105で最大活性を示した。+9〜+105にはTATA-lessプロモーターの一つとして提唱されているHIP1(Housekeeping initiator protein1)の結合するコンセンサス配列、ATTTCN(1-30)GCCAが存在しているが、-52〜+105まで含まないと最大活性が出ないことよりHIP1配列のみでは下流プロモーターの至適活性の発揮には不十分であると考えられた。一方、上流からの転写は-194〜+36で最大となるので、-107〜+36に含まれるCCAAT Box,TATA Box以外に-107〜-194に含まれる別のエレメントが最大活性を出すために必要であろうと推論された。また上流のプロモーターの活性は下流のプロモーターの活性の1/10以下であることが明らかとなり、これは未処理ラット肝のRNAブロット解析で得られた結果と一致する。

(1)Microtransition (Mt) high-order structure of SPT, active and related species (MTS) ) To maintain the composition of coliform bacteria in the body before SPT, the production of the body, the amount of protein, and the specific activity of enzymes were compared. Use いた group み to replace えbody は pRspt1AA (complete なSPTm former 槆body をコード), pRspt3AA (β-GalのN-terminal 7アミノ acid にSPTm front body のArg (3) and the following のalignment が binding fusion protein をコード), pRspt pRsp t10 (β-Gal's N-terminal 7-amino acid, SPTm front body, Asn (22) and the lowering configuration, binding), four kinds of materials. MTS contains a fusion protein and has a specific activity of the same degree as the mature SPT, and MTS contains The amount of くほど発 is が小ない, the protein is すなわち, and the protein is unstable, and it is unstable. Complete なSPTm former body をコードしたクローン, pRspt1AA では protein, active いずれもまったく発见られなかった. The cell-free translation system is used to synthesize SPT and mature SPT, which is digested by Proteinase K, and the SPT is digested preferentially. The results of the existence of MTS and the high-order structure of the SPT enzyme molecule are affected by the influence of MTS and SPT enzyme molecules.ばMTS の EXISTENCE によりSPT がプロテアーゼに対し HIGH SENSITIVITY のほぐれたSTATE になることを Show 唆している. (2) Analysis of the mechanism that determines the writing start position Typical TATA Box たないdegradable のプロモーター(+66より転WRITE)のminimum functional arrangementをpresumptionするために、analysisするcombinationえThe body's SPT legacy body is a 3' side body +105 fixed body, and a 5' upper body body body replacement body is lost in sequence.プロモーターActivity +36~+105でも见られたが, -52~+105でMaximum activityをshowした. +9~+105にはTATA-lessプロモーターの一つとしてTi singされているHIP1(Housekeeping initiator Protein1) binding arrangement, ATTCN(1-30)GCCA presence, -52~+105 Contains the maximum activity of the まないとが出ないことよりHIP1 arrangement のみでは indecentプロモーターの正动の発向には是不了であると考えられた. One party, the upper class is written by -194~+36, the maximum is, -107~+36, it is contained, CCAAT Box, TATA Outside of the Box -107~-194にまれるbieのエレメントが maximum active を出すためにnecessary であろうと inference された.またUpstream のプロモーターのActivity はDownstream のプロモーターのActivity の1/10 or less であることがThe result of the analysis of the RNA of the untreated liver and the unprocessed RNA of the Ming Dynasty was consistent with the result.