ペルオキシソーム酵素の膜透過時の構造解析

膜渗透过程中过氧化物酶体酶的结构分析

基本信息

批准号：
10172208
负责人：
小田敏明
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10172208/
关键词：
セリンアミノ転移酵素ペルオキシソーム膜透過尿酸酸化酵素

项目摘要

ペルオキシソームマトリックス蛋白質がペルオキシソーム膜を通過するとき高次構造は保持されたままなのか、あるいは、変性状態になるのかを検討した。具体的には、ペルオキシソーム酵素の分子内部にロイシン10残基を挿入した変異体を作製し、その培養細胞内発現産物が電顕レベルでペルオキシソームマトリックスに検出されるのか、あるいはベルオキシソーム膜上に検出されるのかを調べた。ロイシン10残基は膜に強く結合すると考えられるので、変性状態を経て膜透過するのであれば、ペルオキシソーム膜面上に固定された染色パターンが見られるはずである。1. 膜固定配列挿入変異体の作製用いたペルオキシソームマトリックス酵素は尿酸酸化酵素、アシルCoA酸化酵素、3-ケトアシルCoAチオラーゼ、セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素の4種である。それぞれの分子内部の3-4箇所にロイシン10残基をコードした塩基配列をフレームをあわせて挿入したクローンを作製した。発現ベクターは高発現が可能なpCAGGSを用いた。2. COS-1細胞へのトランスフェクションと産物の局在金コロイド法により細胞内局在を解析したところ、野性型酵素はいずれもペルオキシソームマトリックス、および細胞質に検出された。ところがロイシン挿入クローンではほとんどの産物がペルオキシソーム以外の細胞質膜系に局在した。ロイシン残基挿入により高次構造が変化し、ペルオキシソーム移行シグナルが抑制されたと考えられた。in vivoの系では分子内部に疎水瀬アミノ酸のクラスターを持つ蛋白質は通常のペルオキシソーム局在経路にのることができないと思われるので、in vitroのペルオキシソーム輸送系で解析することが必要であると結論された。

我们调查了当过氧化物酶体基质蛋白通过过氧化物酶体膜或它是否变成变性态时，高阶结构是否保持保留。具体而言，产生了一个突变体，其中将亮氨酸10残基插入过氧化物酶体酶的分子中，并检查了在电子显微镜水平的过氧化物酶体基质中还是在甲状腺膜膜上检测到过氧化物酶体基质中的培养细胞中表达的产物。由于亮氨酸10残基被认为与膜结合，如果它们通过变性状态渗透，则应看到固定在过氧化物酶体膜表面上的染色模式。 1。膜固定序列插入突变体的制备，使用了四种类型的过氧化物酶体基质酶：尿酸氧化酶，酰基-COA氧化酶，3-酮酰基-COA硫醇酶和丝氨酸：丙酮酸氨基转移酶。制备了一个克隆，其中将编码10个亮氨酸残基的碱基序列插入每个分子内3-4个位置的框架中。表达矢量是PCAGG，它具有高表达。 2。通过胶体金方法分析转染到COS-1细胞中，并分析了产物的定位，并在过氧化物酶体基质和细胞质中检测到所有野生型酶。然而，亮氨酸插入克隆中的大多数产物都定位于过氧化物酶体以外的其他细胞质膜系统。据认为，亮氨酸残基的插入改变了构象并抑制了过氧化物酶体过渡信号。在体内系统中，不能在正常的过氧化物酶体定位途径中进行分子内疏水氨基酸簇的蛋白质，并且可以得出结论，在体外过氧化物酶体传输系统中有必要分析。