ペルオキシソーム酵素の膜透過時の構造解析

ペルオキシソームマトリックス蛋白質がペルオキシソーム膜を通過するとき高次構造は保持されたままなのか、あるいは、変性状態になるのかを検討した。具体的には、ペルオキシソーム酵素の分子内部にロイシン10残基を挿入した変異体を作製し、その培養細胞内発現産物が電顕レベルでペルオキシソームマトリックスに検出されるのか、あるいはベルオキシソーム膜上に検出されるのかを調べた。ロイシン10残基は膜に強く結合すると考えられるので、変性状態を経て膜透過するのであれば、ペルオキシソーム膜面上に固定された染色パターンが見られるはずである。1. 膜固定配列挿入変異体の作製用いたペルオキシソームマトリックス酵素は尿酸酸化酵素、アシルCoA酸化酵素、3-ケトアシルCoAチオラーゼ、セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素の4種である。それぞれの分子内部の3-4箇所にロイシン10残基をコードした塩基配列をフレームをあわせて挿入したクローンを作製した。発現ベクターは高発現が可能なpCAGGSを用いた。2. COS-1細胞へのトランスフェクションと産物の局在金コロイド法により細胞内局在を解析したところ、野性型酵素はいずれもペルオキシソームマトリックス、および細胞質に検出された。ところがロイシン挿入クローンではほとんどの産物がペルオキシソーム以外の細胞質膜系に局在した。ロイシン残基挿入により高次構造が変化し、ペルオキシソーム移行シグナルが抑制されたと考えられた。in vivoの系では分子内部に疎水瀬アミノ酸のクラスターを持つ蛋白質は通常のペルオキシソーム局在経路にのることができないと思われるので、in vitroのペルオキシソーム輸送系で解析することが必要であると結論された。

ペルオキシソームマトリックス蛋白質がペルオキシソーム膜を通過するとき高次構造は保持されたままなのか、あるいは、変性状態になるのかを検討した。具体的には、ペルオキシソーム酵素の分子内部にロイシン10残基を挿入した変異体を作製し、その培養細胞内発現産物が電顕レベルでペルオキシソームマトリックスに検出されるのか、あるいはベルオキシソーム膜上に検出されるのかを調べた。ロイシン10残基は膜に強く結合すると考えられるので、変性状態を経て膜透過するのであれば、ペルオキシソーム膜面上に固定された染色パターンが見られるはずである。1. 膜固定配列挿入変異体の作製用いたペルオキシソームマトリックス酵素は尿酸酸化酵素、アシルCoA酸化酵素、3-ケトアシルCoAチオラーゼ、セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素の4種である。それぞれの分子内部の3-4箇所にロイシン10残基をコードした塩基配列をフレームをあわせて挿入したクローンを作製した。発現ベクターは高発現が可能なpCAGGSを用いた。2. COS-1細胞へのトランスフェクションと産物の局在金コロイド法により細胞内局在を解析したところ、野性型酵素はいずれもペルオキシソームマトリックス、および細胞質に検出された。ところがロイシン挿入クローンではほとんどの産物がペルオキシソーム以外の細胞質膜系に局在した。ロイシン残基挿入により高次構造が変化し、ペルオキシソーム移行シグナルが抑制されたと考えられた。in vivoの系では分子内部に疎水瀬アミノ酸のクラスターを持つ蛋白質は通常のペルオキシソーム局在経路にのることができないと思われるので、in vitroのペルオキシソーム輸送系で解析することが必要であると結論された。