ハプト藻の脂肪酸Δ3不飽和化酵素の特性と同遺伝子のクローニング

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本研究ではハプト藻B株Δ3不飽和化酵素遺伝子のクローニングを中心課題として行った。[方法](1)ゲノミックサザン法:ハプト藻B株の核DNAを各種制限酵素で消化し、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する、ECLによる蛍光ラベルをしたDNA断片(クローン296、302)をプローブとしてサザン法を行った。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:B株の全DNAを鋳型とし、シロイヌナズナのΔ15不飽和化酵素遺伝子に由来する数種類のDNA断片を適宜組み合わせたものをプライマーとしてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、クローン296、302をプローブに用いてサザン法を行った。ポジティブクローンは大腸菌で増幅し、オートシケンサーを用いて塩基配列を決定した。(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株よりmRNAを調製した後、cDNAを合成した。cDNAを鋳型、(2)で用いたDNA断片をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物に対しクローン296、302をプローブとしてサザン法を行った。[結果](1)ゲノミックサザン法:各種制限酵素産物のいずれもがクローン296、302とも相補性を示さなかった。(2)ゲノムDNAを鋳型とするPCR法:PCR産物とクローン296、302とのサザン法により、2つのポジティブクローン(クローン26、27)を得た。これらをBluescriptを用いた系によりサブクローニングし、得られた6クローンをオートシーケンサーにかけた。最終的に既知の不飽和化酵素遺伝子群とのホモロジー検索に供することができたのは1クローン(クローン26C)であり、そのΔ15不飽和化酵素遺伝子とのホモロジーは30%以下であった。(3)cDNAを鋳型とするPCR法:B株のライフサイクルを通じて18:5ω3のレベルの最も高い時期の細胞から調製したpoly(A)^+RNAからcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてPCRを行った。クローン296とクローン302をプローブとしてPCR産物のサザン法を行ったところ、9個のポジティブクローンが得られた。今これらのクローンのシーケンスを行っている。