メダカ胚ES細胞の培養とジーントラップ法による初期発生特異的遺伝子の検索

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1.胚性幹細胞の分離と移植:本研究課題の目的の第一は,胚から分離した細胞の移植によるキメラ・メダカの作製である。昨年の研究によって,メダカの孵化酵素を利用して硬い卵膜を部分消化することでマイクロキャピラリーによる細胞の移植が可能になった。今年度は移植した個体のうち,9匹の雌雄について,移植した細胞が生殖系列に伝達されるかどうかを検討した。9匹のうち,5匹においては,それが産卵した卵の1〜2%に移植した細胞由来のものが含まれていることが確認された。したがって,この研究によってキメラ・メダカでは生殖系列に移植細胞が組み込まれることが明らかになった。2.メダカ胚細胞の培養:メダカ胚から,胚性幹細胞を分離し,フィーダー細胞上に培養した。培養液は,マウスの胚性幹細胞に用いられているものと同等のものを用いた。胚性幹細胞は培養に移したのちも急速に細胞分裂を行ない,また一部の細胞には培養中に分化する傾向が観察された。現在は培養した細胞にキメラ作成能があるかどうかについて検討している。3.メダカ受精卵に対する遺伝子移入:ジーントラップ法を行なうために,メダカの受精卵で第1分裂前に,プロモーターを持たないマーカー遺伝子lacZを注入する実験を行ない,その個体が成熟したのちに,産卵した卵を固定し,X-gal染色をおこなった。50匹以上の個体について検討したが,陽性の卵は認められなかった。