胚性幹細胞を利用した遺伝子改変ニワトリの作出に関する研究

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本研究は,新規のニワトリ胚性幹(cES)細胞を利用して,遺伝子改変ニワトリを作出することを目的として実施した.本年度は,遺伝子組換えcES細胞由来の後代取得と効率化が可能であるか検証を行った.本研究では,相同遺伝子組換えを含め遺伝子操作後のcES細胞を移植したキメラニワトリから4,000羽を超えるヒナの確認を行ったが,cES細胞由来の後代は取得出来なかった.この原因の一つには,核型異常が考えられた.本研究では,cES細胞中に遺伝子操作前であっても2-10%程度の核型異常細胞が存在し,特にランダムインテグレートで遺伝子導入した細胞では,この割合が90%を超えることが明らかとなった.そのため,生殖細胞が正常に機能できないのではないかと考えられた.一方で,クローニング後の細胞や,相同遺伝子組換えで遺伝子導入した細胞では,核型異常細胞の割合が導入前と同程度まで低下しており,正常な核型の維持に向け有効な手段と考えられた.また目的の後代が得られない原因には,生殖細胞へ分化したcES細胞の数が少ないことも考えられた.本研究では,この点を改善するためin vitro分化誘導条件の検証を行ったが,cES細胞におけるニワトリ生殖系列特異的遺伝子(Cvh)の発現を向上させる条件の解明には至らなかった.そのため,本研究ではcES細胞を移植した胚からキメラの始原生殖細胞を回収し薬剤選抜を行った.その結果,緑色蛍光タンパク質を発現し,かつCvh陽性の細胞が培養可能であった.この手法は,今後生殖細胞への分化効率を向上させる上で有効な手法になり得ると考えられる.本研究では,目的の遺伝子改変ニワトリ個体作出には至らなかったものの,必要な基盤技術の証明にはほぼ成功しており,今後の研究によってニワトリにおいてノックイン・ノックアウトを含めた遺伝子改変技術を実用化させることが可能になるものと考えられる.