転写制御タンパク質の大腸菌による大量発現および高次構造に基づく機能解析

本研究は薬物代謝酵素P4501A1の発現を調節する転写制御タンパク質の機能ドメインを大腸菌を用いて大量発現させ、精製の後、タンパク質の高次構造解析の結果と関連づけて作用機構を解析することが目的である。P-4501A1遺伝子の転写制御領域は2種類あり、BTE(Basic trans-criptional element)は構成的発現に、XRE(Xenobiotic responsive element)は誘導的発現に必要である。各々の領域には特異的な転写制御タンパク質が結合して転写を調節する。BTEに結合する転写因子BTEBのDNA結合領域は3回連続するZn-フィンガーモチーフとそのN末端側に隣接する塩基性配列を含む。このDNA結合領域の大腸菌での大量発現・精製を完了し、キャラクタリゼーションの結果を報告した。13-C、15-Nでダブルラベルしたタンパク質の高次構造は東京都臨床医学総合研究所の稲垣冬彦博士の協力により、三重共鳴三次元NMR法による解析が進行中である。現在、約70%のシグナルの同定が完了した。さらにこのタンパク質とDNAとの複合体の高次構造解析も開始した。これによりタンパク質とDNAの相互作用をより詳細に理解できると期待される。P4501A1の誘導的発現に必要なXRE領域に結合するタンパク質はAhR(Arylhydrocarbon Receptor)とArnt(AhR nuclear translocator)のヘテロ二量体である。両タンパク質はDNA結合ドメイン(bHLH)、リガンド結合ドメイン(PAS)、二量体形成ドメイン(bHLH+PAS)をもつ新しいタイプの受容体型転写因子である。すでに、両者のbHLH+PASドメインを大腸菌で発現させ、DNA結合活性をもつヘテロ二量体の形成に成功した。しかし、大量発現を試みると大部分が不溶性となり高次構造解析に適した試料の調製は困難であった。そこで、GST-やHis-タグドメインはタンパク質の精製には都合が良いが不溶性の原因になると考え、これらを含めずに目的の配列のみからなるタンパク質を発現させてこの問題点を解決しようと検討中である。

本研究は薬物代謝酵素P4501A1の発現を調節する転写制御タンパク質の機能ドメインを大腸菌を用いて大量発現させ、精製の後、タンパク質の高次構造解析の結果と関連づけて作用機構を解析することが目的である。P-4501A1遺伝子の転写制御領域は2種類あり、BTE(Basic trans-criptional element)は構成的発現に、XRE(Xenobiotic responsive element)は誘導的発現に必要である。各々の領域には特異的な転写制御タンパク質が結合して転写を調節する。BTEに結合する転写因子BTEBのDNA結合領域は3回連続するZn-フィンガーモチーフとそのN末端側に隣接する塩基性配列を含む。このDNA結合領域の大腸菌での大量発現・精製を完了し、キャラクタリゼーションの結果を報告した。13-C、15-Nでダブルラベルしたタンパク質の高次構造は東京都臨床医学総合研究所の稲垣冬彦博士の協力により、三重共鳴三次元NMR法による解析が進行中である。現在、約70%のシグナルの同定が完了した。さらにこのタンパク質とDNAとの複合体の高次構造解析も開始した。これによりタンパク質とDNAの相互作用をより詳細に理解できると期待される。P4501A1の誘導的発現に必要なXRE領域に結合するタンパク質はAhR(Arylhydrocarbon Receptor)とArnt(AhR nuclear translocator)のヘテロ二量体である。両タンパク質はDNA結合ドメイン(bHLH)、リガンド結合ドメイン(PAS)、二量体形成ドメイン(bHLH+PAS)をもつ新しいタイプの受容体型転写因子である。すでに、両者のbHLH+PASドメインを大腸菌で発現させ、DNA結合活性をもつヘテロ二量体の形成に成功した。しかし、大量発現を試みると大部分が不溶性となり高次構造解析に適した試料の調製は困難であった。そこで、GST-やHis-タグドメインはタンパク質の精製には都合が良いが不溶性の原因になると考え、これらを含めずに目的の配列のみからなるタンパク質を発現させてこの問題点を解決しようと検討中である。