転写制御タンパク質機能ドメインの大量発現および高次構造解析

转录调节蛋白功能域的大规模表达和构象分析

基本信息

  • 批准号:
    12034205
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.02万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
  • 财政年份:
    2000
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2000 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究は外界シグナルに応答する転写制御タンパク質の作用をその機能ドメインの高次構造にもとづいて理解することを目的とする。薬物代謝酵素CYP1A1遺伝子の5'-上流には構成的転写調節配列BTEと誘導的転写調節配列XREがあり、それぞれ特異的な転写制御タンパク質が結合してCYP1A1の発現を制御している。(1)BTEB(BTE-binding protein)のDNA結合ドメインであるZn-フィンガーモチーフを13-C、15-N二重ラベルして稲垣冬彦教授(北大)のご協力でNMR解析したがシグナルが約80%しか検出されず高次構造には至らなかった。そこで、2-H、13-C、15-N三重ラベルタンパク質のDNA複合体をTROSY解析する計画をたてた。まず15-Nラベル体を用いてhsqcスペクトルによるDNA複合体調製条件の至適化を行った。(2)XREに結合するのはAhRとArntのヘテロニ量体で、両者ともbHLHとPASドメインを持つ新しい型の転写因子である。PASはサブドメインPAS-AとPAS-Bを含みタンパク質間相互作用の特異性を決定する。マウスArnt2のPAS-Aを大腸菌で大量発現させ精製したが6merに会合していてNMR解析には不向きであった。しかしこれを結晶化することに成功し、X線結晶解析への可能性を開いた。(3)Arnt3とClockはともにbHLH-PASをもつ転写因子で両者のヘテロ二量体は日周リズム形成に重要な役割をはたす。欠失変異体を解析しマウスClockのアミノ酸492-559の領域がヘテロ二量体形成やDNA結合活性には影響せず転写活性化のみに重要であることを明らかにした。さらにArnt3/Clockヘテロ二量体による転写活性化にはCBPやP300がcoactivatorとして作用することを示した。
This study aims to understand the function and purpose of higher-order structure of the system. The 5'-upstream of CYP1A1 gene is composed of BTE and XRE, which are specific to CYP1A1 gene. (1) The DNA binding profile of BTEB(BTE-binding protein) was analyzed by 13-C, 15-N double-stranded NMR with the cooperation of Professor Fuyuhiko Inigaki (Peking University). The TROSY analysis of DNA complexes with 2-H, 13-C and 15-N triplex was carried out. Optimization of DNA complex modulation conditions for 15-N complex (2)XRE is associated with a new type of writing factor. PAS-A and PAS-B contain the specificity of plasma-to-mass interactions. Arnt2 and PAS-A were found in large quantities and purified by NMR analysis. The possibility of successful crystallization and X-ray crystallization analysis is open. (3)Arnt3 and Clock are the most important factors in the formation of the cycle. It has become clear that the field of MukusClock's amino acids 492-559 is important for the formation of tetranucleotide and DNA binding activity, which affect the activation of DNA in six days. Arnt3/Clock is the first to activate CBP P300 as a coactivator.

项目成果

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