転写制御タンパク質機能ドメインの大量発現および高次構造解析

转录调节蛋白功能域的大规模表达和构象分析

基本信息

  • 批准号:
    11160201
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.9万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
  • 财政年份:
    1999
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1999 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

受容体型転写因子AhR(Aryl hydrocarbon receptor)はダイオキシンなど外来の多環性芳香族化合物を結合した後、Arnt(AhR nuclear translocator)とヘテロ二量体を形成して薬物代謝酵素CYPlA1遺伝子の誘導的転写調節配列XRE(Xenobiotic responsive element)に結合して転写を活性化する。AhR、ArntともにPAS(Per-AhR/Arnt-Sim homology)という新しい構造モチーフを持つ。PASはサブドメインPAS-A、PAS-Bを含み、タンパク質間相互作用に重要な役割を持つ。本研究はPASの機能ドメインの高次構造解析を目的とした。(1)アミノ酸配列ホモロジーに基づいたPAS-A、PAS-Bは大腸菌で発現させると大部分が不溶性だったがマウスArnt2のPAS-Aは可溶性で精製も進んだ。しかし巨大な会合体を形成したため1残基含まれるCysをSerに変換したところ高次会合体形成は抑制され、AhR-Arntヘテロ二量体の形成を競合的に阻害する活性も示したのでCys-Ser変換は有効な対策であった。しかし依然として4〜6量体なのでオクチルグルコシド、Tween20などの界面活性剤を加えると、二量体の形成が特に強まり規則性のより高い構造をとった。稲垣冬彦教授(北大)のご協力によりNMR高次構造解析に着手した。(2)SDS-PAGEと非変性PAGEの結果からこのタンパク質は電荷的にも分子量的にも均一なので会合の様式も均一と結論した。これにより均一な会合体を結晶化しX線結晶解析を適用する可能性が明らかになった。(3)アミノ酸配列ホモロジーによらずにインタクトな構造フレームに合致した構造ドメインを確定するには全長のタンパク質をタンパク質分解酵素で限定消化する必要がある。星川裕博士(都臨床研)のご協力を得てArnt全長タンパク質の昆虫細胞Sf9での発現量を大幅に増加させることに成功した。
The capacitive writing factor AhR (Aryl hydrocarbon receptor) was coupled with exotic polyambient aromatic compounds, and then Arnt (AhR nuclear translocator) conjugated to form a derivative of the enzyme CYPlA1 spool. The XRE (Xenobiotic responsive element) column was combined with the enzyme XRE (Xenobiotic responsive element) column. AhR, Arntology, PAS (Per-AhR/Arnt-Sim homology), new equipment, new equipment, high performance, good performance. The interaction between PAS-An and PAS-B is very important for the maintenance of important service cutting equipment. In this study, the PAS machine was able to improve the performance of high-order analysis. The main results are as follows: (1) the concentration of PAS-A, PAS-B, aspergillus spp. shows that most of them are insoluble, insoluble, PAS-A, soluble, soluble. The formation of the fusion body of the giant body shows that the residual gene contains the residue of the Cys, the Ser, the inhibition, the inhibition, the activity, the inhibition, the Cys-Ser, the inhibition, the inhibition. We still need to measure the size of the body, increase the interfacial activity of Tween20, and improve the performance of the two-dimensional system. Professor Toshihiko Takagaki (Peking University) made a concerted effort to develop the high-level analysis of NMR. (2) the results of SDS-PAGE non-linear PAGE results the molecular weight of the electric charge is uniform. The crystal analysis of the X-ray crystal of the uniformly jointed body is used to analyze the possibility of the use of the alloy. (3) in order to make sure that the total length of the enzyme is determined, the digestion of the necessary enzymes is limited. Dr. Yukawa Seikawa (Toshiyuki) worked hard to achieve a large increase in the overall length of the Arnt, the insect cell Sf9, and the success rate.

项目成果

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