Analyses of a hematopoietic regulatory region of transcription factor GATA-2 gene and an application of the region to in vitro proliferation of hematopoietic stem cells.

转录因子GATA-2基因造血调控区分析及其在造血干细胞体外增殖中的应用

基本信息

  • 批准号:
    16591006
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.3万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    2004
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2004 至 2005
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1.Construction of an adenovirus vector aiming for the proliferation of hematopoietic stem cells.To generate infectious viral vector, I employed a method based on Cre/loxP-mediated recombination (AdMax^<TM>, Microbix Biosystems Inc.). A common method for constructing adenovirus vectors relies on in vivo homologous recombination between two separate vectors, one of which is a modified viral genomic vector, and the other of which is a shuttle vector used to introduce the gene of interest. However, the homologous recombination efficiency in this case is very low, while Cre-mediated loxP recombination is extremely efficient. As the first experimental step, mGATA-2 cDNA was cloned into the shuttle vector.2.Analyses of a hematopoietic regulatory region of transcription factor GATA-2 geneAn essential 5 kbp genomic region for GATA-2 hematopoietic expression, which is located between 145 and 150 kbp from the transcription initiation site, has been identified. I was able to localize this discrete … More element after intensively examining a series of deletions of a yeast artificial chromosome (YAC) harboring the GATA-2 locus. While the YAC enables analyses of long-range genomic interactions, the difficulties inherent in manipulating YACs makes them inappropriate for detailed analyses of small regions of interest. Therefore, I devised a co-stable transfection system of DNA fragments of -150 essential region, resulting in linkage of multiple copies of the fragment to the promoter directing the expression of GFP. In this system, We can readily detect the activity of the essential region by flowcytometric analyses without any cell staining. A series of internal deletions of the region revealed a 1.5 kbp core activity in NcoI-SpeI, locating in the middle of the essential region (Appendix, Fig. 4). The nucleotide sequence of the 1.5 kbp fragment revealed several perfect candidate sites for the binding of regulatory factors, including SCL and AML-1. Ianticipate that further dissection of the core element may lead to the identification of a novel mesodermal factor, which we would then examine in greater detail. As soon as the significance of each trans-acting factor on the regulation of GATA-2 is confirmed by further analyses, such factors may also be applied to the in vitro expansion system of hematopoietic stem cells. Less
1.为了产生感染性病毒载体,我采用了基于Cre/loxP介导的重组的方法(AdMax ®<TM>,Microbix Biosystems Inc.)。构建腺病毒载体的常用方法依赖于两个单独载体之间的体内同源重组,其中一个是修饰的病毒基因组载体,另一个是用于引入目的基因的穿梭载体。然而,这种情况下的同源重组效率非常低,而Cre介导的loxP重组非常有效。作为实验的第一步,将mGATA-2 cDNA克隆到穿梭载体中。2.转录因子GATA-2基因造血调控区的分析已鉴定出加塔-2造血表达所必需的5 kbp基因组区域,其位于转录起始位点的145和150 kbp之间。我能够定位这个离散的 ...更多信息 在深入研究了一系列含有加塔-2基因座的酵母人工染色体(YAC)缺失后,虽然YAC能够分析长距离基因组相互作用,但操纵YAC的固有困难使其不适合对感兴趣的小区域进行详细分析。因此,我设计了一个共稳定的转染系统的DNA片段的-150必需区,导致连接的多个拷贝的片段的启动子指导GFP的表达。在此系统中,我们可以通过流式细胞术分析而不需要任何细胞染色来容易地检测必需区域的活性。该区域的一系列内部缺失揭示了NcoI-SpeI中1.5 kbp的核心活性,位于必需区域的中间(附录,图4)。1.5 kbp片段的核苷酸序列揭示了几个完美的候选位点的调节因子,包括SCL和AML-1的结合。我预计,进一步解剖的核心元件可能会导致一个新的中胚层因子的鉴定,我们将在更详细的研究。一旦通过进一步的分析证实了每种反式作用因子对加塔-2调节的重要性,这些因子也可以应用于造血干细胞的体外扩增系统。少

项目成果

期刊论文数量(8)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Predictive value of the original content of CD34+ cells for enrichment of hematopoietic progenitor cells from bone marrow harvests by the apheresis procedure.
CD34细胞原始含量对通过单采术操作从骨髓收获物中富集造血祖细胞的预测价值。
  • DOI:
  • 发表时间:
    2006
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Tazawa Y;Ohura T et al.;Itoh T
  • 通讯作者:
    Itoh T
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