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銅タンパク質の電子メディエーター機能に関する研究

铜蛋白电子介体功能的研究

基本信息

批准号：
06226230
负责人：
民谷栄一
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、銅イオンを活性中心に有するオキシダーゼであり、アミノ酸残基が直接電子授受を行う重要なサイトとして考えられているガラクトースオキシダーゼ(GAO)を用いて、その酸化還元反応を電気化学的に制御すると共に、電子伝達機能の解析を行うことを検討した。まず、GAOと電子授受を行うメディエーターを選択するために、1-Methoxy PMS,Meldolas'Blue,p-Bezoquinone,Ferrocenylmethyl-trimethylammonium bromide,Ferrocene monocarboxylic aciなどを検討した。その結果、Ferrocene monocarboxylic acidをpH9の緩衝液中で用いた場合、良好なメディエーターとして機能することが明らかとなった。Ferrocenylmethyl trimethylammonium bromideも電流の増加を示したが酸素の酸化電流の影響を受けやすい電位であるため明確なメディエーター機能を認めることはできなかった。なお、その他のメディエーターとGAOとの電子授受は観測されなかった。次に、Ferrocene monocarboxylic acidを用いてk_f/a vs. 1/sプロットによりk_f(pseudo-first-order rate constant)及びk_s(=k_f/[z])(homogeneous second-order rate constant)を算出したところ、k_f=65.2s^<-1>,k_s=13.0x10^5l mol^<-1> s^<-1>の値が得られた。なおGAOはpH=6付近に酵素活性の最大が認められるが、Ferrocene monocarboxylic acidを用いた場合にはpHが6及び7の時には、メディエーター機能を示さなかった。このことは、Ferrocene monocarboxylic acidとGAOとの相互作用のpH依存性を反映している。Ferrocene monocarboxylic acidがメディエーター機能を示したpH=9の状態は本来の酵素の最適条件とは異なり若干変性した状態とも考えられる。そこで積極的に変性剤を用いてGAOに構造変化を与え、メディエーターとの電子授受への影響について調べた。そこで変性剤として塩酸グアニジンを用い、変性剤の濃度を変化させることによりGAOの構造変化にともなう、I_k(kinetically-controlled current)/I_d(diffusion-controlled current)の変化を測定した。その結果、1Mの塩酸グアニジンを共存させたところ、10%以下にI_k/I_d値が減少した。そこで次にGAOの反応基質としてガラクトースの代わりに3-Methoxybenzyl alcoholを用いて同様の実験を行ったところ、1Mの塩酸グアニジンを共存下でも未変性時の約30%のI_k/I_d値を保持した。このことは基質に対する酵素の反応特異性が変性過程で異なることを示すと考えられた。

In this study, we investigated the important role of acid residues in direct electron transfer between copper and copper active centers, and the role of acid residues in electrochemistry. 1-Methoxy PMS,Meldolas'Blue,p-Bezoquinone,Ferrocenylmethyl-trimethylammonium bromide,Ferrocene monocarboxylic aci. Results: Ferrocene monocarboxylic acid pH9 buffer used in the case, good performance Ferrocenylmethyl trimethylammonium bromide current increase indicates that the acid acidification current is affected by the potential.なお、その他のメディエーターとGAOとの电子授受は観测されなかった。In addition, the values of k_f(pseudo-first-order rate constant) and k_s(=k_f/[z])(homogeneous second-order rate constant) for Ferrocene monocarboxylic acid were calculated, k_f=65.2s^<-1>,k_s=13.0x10^5l mol^<-1>s^<-1>. GAO has the highest enzyme activity at pH 6 and Ferrocene monocarboxylic acid at pH 6 and pH 7. The pH dependence of the interaction between Ferrocene monocarboxylic acid and GAO is reflected in the reaction. Ferrocene monocarboxylic acid can be used to determine the optimal pH value of the enzyme. The active nature of the agent used in the GAO structure changes with the influence of the electron transfer. In addition, the structural change of GAO and the change of I_k(kinetically-controlled current)/I_d(diffusion-controlled current) were determined. As a result, the ratio of I_k/I_d decreases below 10%. The ratio of I_k/I_d of GAO to 3-Methoxybenzyl alcohol was maintained at about 30% of the time when GAO was not active. The enzyme specificity of the substrate is different from that of the substrate.