ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

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1.ジャガイモUDP-グルコースピロホスホリラーゼ(合成酵素)のX線結晶解析を継続することにより、3つのドメインの構造については、ほぼ完全に主鎖の折れたたみを明らかにすることができたが、なおそれらの間をつなぐループを決定するには至っていない。従って、全体の立体構造モデルにおける残基番号は明らかにすることはできていない。現在、重原子置換のデータを入れ直すことによって、さらに詳細な検討に入っているので、ごく近いうちに、全体構造を明らかにすることができるものと期待される。また、大腸菌UDP-グルコースピロホスホリラーゼを大量発現させて、UDP-ピリドキサールを用いた親和標識と部位特異的変異導入の実験を行った。その結果、植物酵素と細菌酵素の間では、全体的な一次構造が相違しているだけでなく、それらの活性部位の構造と触媒反応機構も大きく異なっていることが明らかになった。現在、大腸菌酵素の結晶化を進めており、そのX線結晶解析に入る予定である。2.アデニル酸キナーゼの活性部位アミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、この酵素の基質ヌクレオチドモノリン酸に対する特異性を改変しようという試みをさらに進めるために、本年はその対照として基質特異性の異なるUMP-CMPキナーゼのcDNAをブタ脳から単離して、ヌクレオチド配列順序を決定すると共に、その高発現系を構築した。アデニル酸キナーゼの活性部位を構成するアミノ酸と比較することにより、特徴的なアミノ酸の置換を見いだすことができたので、それを基にして効果的な特異性の改変を実現することができた。改変酵素では、ATPよりもCMPに対する触媒活性が高くなっている。現在、これら改変酵素の結晶化を進めている。