ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

核苷酸结合位点动态结构分析

• 批准号: 06235212
• 负责人: 福井 俊郎
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06235212/
• 关键词: ヌクレオチド結合部位; アデニル酸キナーゼ; UDPGピロホスホリラーゼ

1.ジャガイモUDP-グルコースピロホスホリラーゼ(合成酵素)のX線結晶解析を継続することにより、3つのドメインの構造については、ほぼ完全に主鎖の折れたたみを明らかにすることができたが、なおそれらの間をつなぐループを決定するには至っていない。従って、全体の立体構造モデルにおける残基番号は明らかにすることはできていない。現在、重原子置換のデータを入れ直すことによって、さらに詳細な検討に入っているので、ごく近いうちに、全体構造を明らかにすることができるものと期待される。また、大腸菌UDP-グルコースピロホスホリラーゼを大量発現させて、UDP-ピリドキサールを用いた親和標識と部位特異的変異導入の実験を行った。その結果、植物酵素と細菌酵素の間では、全体的な一次構造が相違しているだけでなく、それらの活性部位の構造と触媒反応機構も大きく異なっていることが明らかになった。現在、大腸菌酵素の結晶化を進めており、そのX線結晶解析に入る予定である。2.アデニル酸キナーゼの活性部位アミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、この酵素の基質ヌクレオチドモノリン酸に対する特異性を改変しようという試みをさらに進めるために、本年はその対照として基質特異性の異なるUMP-CMPキナーゼのcDNAをブタ脳から単離して、ヌクレオチド配列順序を決定すると共に、その高発現系を構築した。アデニル酸キナーゼの活性部位を構成するアミノ酸と比較することにより、特徴的なアミノ酸の置換を見いだすことができたので、それを基にして効果的な特異性の改変を実現することができた。改変酵素では、ATPよりもCMPに対する触媒活性が高くなっている。現在、これら改変酵素の結晶化を進めている。

1. ジ ャ ガ イ モ UDP - グ ル コ ー ス ピ ロ ホ ス ホ リ ラ ー ゼ (synthetic enzyme) の X-ray crystal parsing を 継 続 す る こ と に よ り, 3 つ の ド メ イ ン の tectonic に つ い て は, ほ ぼ に completely master lock の fold れ た た み を Ming ら か に す る こ と が で き た が, な お そ れ ら の between を つ な ぐ ル ー プ を decided す る に は to っ て い な い . All the の 従 っ て, three-dimensional structure モ デ ル に お け る residues mash は Ming ら か に す る こ と は で き て い な い. Now, heavy atom displacement の デ ー タ を straight into れ す こ と に よ っ て, さ ら に detailed な beg に 検 into っ て い る の で, ご く nearly い う ち に, all the tectonic を Ming ら か に す る こ と が で き る も の と expect さ れ る. ま た, coliform UDP - グ ル コ ー ス ピ ロ ホ ス ホ リ ラ ー ゼ を large 発 now さ せ て, UDP - ピ リ ド キ サ ー ル を with い た affinity logo と site specific - different import の be 験 を line っ た. , plant enzyme と そ の results between bacterial enzyme の で は, all な a tectonic が conceives し て い る だ け で な く, そ れ ら の active site の tectonic と catalyst も big き 応 authorities く different な っ て い る こ と が Ming ら か に な っ た. Now, the crystallization of escherichia coli enzyme is を entered into めてお めてお, and the X-ray crystallization analysis of そ is に entered into る to determine である. 2. ア デ ニ ル acid キ ナ ー ゼ の active site ア ミ ノ acid を he の ア ミ ノ acid に replacement す る こ と に よ っ て, こ の の enzyme substrate ヌ ク レ オ チ ド モ ノ リ ン acid に す seaborne る specificity を change - し よ う と い う try み を さ ら に into め る た め に, this year は そ の polices according to と し て substrate specificity の different な る UMP party - CMP キ ナ ー ゼ の cDN A を ブ タ 脳 か ら 単 from し て, ヌ ク レ オ チ ド combination column order を decided す る と に, そ の high 発 now is を build し た. ア デ ニ ル acid キ ナ ー ゼ の active site を constitute す る ア ミ ノ acid と compare す る こ と に よ り, trevor 徴 な ア ミ ノ acid の replacement を see い だ す こ と が で き た の で, そ れ を base に し て unseen fruit な specificity の change - を be presently す る こ と が で き た. The activity of the modification enzyme で る, ATPよ よ <s:1> and <s:1> CMPに against the する catalyst is が high くなって and る る る. Now, <s:1> れら modifies the enzyme を into めて る る る.

项目成果

S.A.Hossain,K.Tanizawa,T.Fukui: "Overproduction and Characterization of Recombinant UDP-Glucose Pyrophosphorylase from Escherichia coli K-12." Journal of Biochemistry. 115. 965-972 (1994)

S.A.Hossain、K.Tanizawa、T.Fukui：“大肠杆菌 K-12 重组 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的过量生产和表征。”

K.Furukawa,M.Tagaya,K.Tanizawa,T.Fukui: "I dentification of Lys-277 at the Active Site of Escherichia coli Glycogen Synthase" Journal of Biological Chemistry. 269. 868-871 (1994)

K.Furukawa，M.Tagaya，K.Tanizawa，T.Fukui：“I 鉴定大肠杆菌糖原合成酶活性位点的 Lys-277”生物化学杂志。

C.Hountondji,S.Gillet,J.-M.Sehmitter,T.Fukui,S.Blanquet.: "Affinity Labeling of the Two Species of Escherichia coli Lysyl-tRNA Synthetase with Adenosine Di-and Triphosphopyridoxals" Journal of Biochemsitry. 116. 493-501 (1994)

C.Hountondji、S.Gillet、J.-M.Sehmitter、T.Fukui、S.Blanquet.：“用腺苷二磷酸和三磷酸吡哆醛对两种大肠杆菌赖氨酰-tRNA 合成酶进行亲和标记”生物化学杂志。

C.Hountondji,S.Gillet,J.-M.Sehmitter,T.Fukui,S.Blanquet.: "Affinity Labeling of Escherichia coli Lysyl-tRNA Synthetase with Adenosine-Di-and Triphosphopyridoxals" Journal of Biochemsitry. 116. 502-507 (1994)

C.Hountondji、S.Gillet、J.-M.Sehmitter、T.Fukui、S.Blanquet.：“用腺苷二磷酸和三磷酸吡哆醛对大肠杆菌赖氨酰-tRNA 合成酶进行亲和标记”生物化学杂志。

T.Okajima,S Goto,K.Taniawa,M.Tagaya,T.Fukui,H.Shimofuruya,J.Suzuki: "Cloning,Sequencing,and Expression in Escherichia coli of cDNA Encoding Procine Brain UMP-CMP kinase" Journal of Biochemistry. (in press). (1995)

T.Okajima，S Goto，K.Taniawa，M.Tagaya，T.Fukui，H.Shimofuruya，J.Suzuki：“编码猪脑 UMP-CMP 激酶的 cDNA 的克隆、测序和在大肠杆菌中的表达”生物化学杂志