修飾ヌクレオチドによる生体環境場における情報伝達系の光制御

本研究は遺伝子DNAあるいは外来遺伝子に起因する病気の発現を、光化学反応を利用して異常遺伝子を確実にブッロックすることを狙った光化学的遺伝子発現抑制法の開発のための基礎研究である。本年度は、光駆動型薬剤として光駆動部位を付加したオリゴヌクレオチド(F-DNA)を合成し、反応場となる細胞への導入手法と細胞内移行プロセスを検討し、次の結果を得た。1)調製リポソームは直径約100nmの多層膜である。リポソームに包埋されたF-DNAの漏出率は2%/h(37℃)で、リポソームの安定性は良好と判明した。2)F-DNA/リポソームの蛍光は細胞内のリソソーム様小器官と核小体から検出され、F-DNAは細胞内のこれらの部位に親和することを明らかにした。核小体内に観測されるF-DNAの蛍光は時間と共に指数関数的に減少した。この蛍光の減少は、F-DNAの蛍光がF-DNAの水溶液中では励起に対して極めて安定なことから、F-DNAが核小体内に存在する一本鎖DNAかrRNAに光結合したためと考察した。3)αーターチエニル標識リポソームの蛍光はリソソーム様小器官から検出されたが、細胞膜からは検出されなかった。このことはリポソームの細胞内移行過程がエンドサイトーシスによることを強く示唆した。4)無蛍光基質フルオレセイン-(β-D-ガラクトピラノシド)(略 FDG)はリソソームマーカー酵素β-ガラクトシダーゼ(略 β-gal)活性により蛍光物質フルオレセインを生成する。F-DNAの細胞内移行過程がリソソームを経由するかどうかを明らかにするため、FDG包埋リポソームを調製し細胞内の親和部位の蛍光観察を行った。フルオレセインの蛍光はリソソームと核小体から検出され、F-DNA/リポソームの細胞内の蛍光分布と一致した。フルオレセインの蛍光が核小体内に観測されたことから、F-DNA/リポソームはリソソーム内で多層膜リポソームの崩壊過程をへて核小体へ移行したと考察した。

本研究は遺伝子DNAあるいは外来遺伝子に起因する病気の発現を、光化学反応を利用して異常遺伝子を確実にブッロックすることを狙った光化学的遺伝子発現抑制法の開発のための基礎研究である。本年度は、光駆動型薬剤として光駆動部位を付加したオリゴヌクレオチド(F-DNA)を合成し、反応場となる細胞への導入手法と細胞内移行プロセスを検討し、次の結果を得た。1)調製リポソームは直径約100nmの多層膜である。リポソームに包埋されたF-DNAの漏出率は2%/h(37℃)で、リポソームの安定性は良好と判明した。2)F-DNA/リポソームの蛍光は細胞内のリソソーム様小器官と核小体から検出され、F-DNAは細胞内のこれらの部位に親和することを明らかにした。核小体内に観測されるF-DNAの蛍光は時間と共に指数関数的に減少した。この蛍光の減少は、F-DNAの蛍光がF-DNAの水溶液中では励起に対して極めて安定なことから、F-DNAが核小体内に存在する一本鎖DNAかrRNAに光結合したためと考察した。3)αーターチエニル標識リポソームの蛍光はリソソーム様小器官から検出されたが、細胞膜からは検出されなかった。このことはリポソームの細胞内移行過程がエンドサイトーシスによることを強く示唆した。4)無蛍光基質フルオレセイン-(β-D-ガラクトピラノシド)(略 FDG)はリソソームマーカー酵素β-ガラクトシダーゼ(略 β-gal)活性により蛍光物質フルオレセインを生成する。F-DNAの細胞内移行過程がリソソームを経由するかどうかを明らかにするため、FDG包埋リポソームを調製し細胞内の親和部位の蛍光観察を行った。フルオレセインの蛍光はリソソームと核小体から検出され、F-DNA/リポソームの細胞内の蛍光分布と一致した。フルオレセインの蛍光が核小体内に観測されたことから、F-DNA/リポソームはリソソーム内で多層膜リポソームの崩壊過程をへて核小体へ移行したと考察した。