Saccharomyces酵母を用いたペルオキシソームタンパク選別輸送の解析

我々はペルオキシソームの誘導発達条件の選別が難しかったSaccharomyces cerevisiae酵母でペルオキシソームの誘導発達条件を見いだすとともに、本酵母内でCandida酵母のペルオキシソーム酵素をコードする遺伝子や変異欠失させた遺伝子を高発現させ、本酵母内に発達させたペルオキシソーム内に輸送させる系の確立に成功した。このS.cerevisiae内でペルオキシソームの発達と協調して発現する系とCandida酵母のペルオキシソーム酵素であるイソクエン酸リアーゼの遺伝子、この場合、特にペルオキシソーム局在シグナルの候補の一つでもあるC末の3アミノ酸残基を欠失させた遺伝子を発現させたところ、そのタンパクの形態は従来のものとは異なっており、また局在を追跡したところ、ペルオキシソームにはたどりついているものの、ペルオキシソーム膜認識後、膜上でプロテアーゼによって切断されていた。このことから本酵素にはペルオキシソーム膜認識において従来いわれているC末以外にも膜識別シグナルが存在していることが予想され、開発してきた系を用いてそのシグナルの探索を行った。1.イソクエン酸リアーゼのC末端AKVを欠失させた分子以外に、C末領域や内部配列の一部を欠失した分子を作製して発現させたところ、免疫電子顕微鏡観察から内在残基の欠失により、本酵素がミトコンドリアに誤って局在することがわかった。2.上記結果を細胞分画法やWestern blot法によりさらに詳細に確かめてみると、本酵素はC末端の従来から言われているSKLモチーフとしてのペルオキシソーム認識配列以外に、N末側にミトコンドリア認識シグナル、さらに内部にペルオキシソーム認識内在シグナルが存在することが判明した。

我々はペルオキシソームの誘導発達条件の選別が難しかったSaccharomyces cerevisiae酵母でペルオキシソームの誘導発達条件を見いだすとともに、本酵母内でCandida酵母のペルオキシソーム酵素をコードする遺伝子や変異欠失させた遺伝子を高発現させ、本酵母内に発達させたペルオキシソーム内に輸送させる系の確立に成功した。このS.cerevisiae内でペルオキシソームの発達と協調して発現する系とCandida酵母のペルオキシソーム酵素であるイソクエン酸リアーゼの遺伝子、この場合、特にペルオキシソーム局在シグナルの候補の一つでもあるC末の3アミノ酸残基を欠失させた遺伝子を発現させたところ、そのタンパクの形態は従来のものとは異なっており、また局在を追跡したところ、ペルオキシソームにはたどりついているものの、ペルオキシソーム膜認識後、膜上でプロテアーゼによって切断されていた。このことから本酵素にはペルオキシソーム膜認識において従来いわれているC末以外にも膜識別シグナルが存在していることが予想され、開発してきた系を用いてそのシグナルの探索を行った。1.イソクエン酸リアーゼのC末端AKVを欠失させた分子以外に、C末領域や内部配列の一部を欠失した分子を作製して発現させたところ、免疫電子顕微鏡観察から内在残基の欠失により、本酵素がミトコンドリアに誤って局在することがわかった。2.上記結果を細胞分画法やWestern blot法によりさらに詳細に確かめてみると、本酵素はC末端の従来から言われているSKLモチーフとしてのペルオキシソーム認識配列以外に、N末側にミトコンドリア認識シグナル、さらに内部にペルオキシソーム認識内在シグナルが存在することが判明した。