神経細胞死の制御要因としての可溶性カルシウムの結合蛋白質

可溶性钙结合蛋白作为神经元细胞死亡的调节剂

基本信息

批准号：
07264228
负责人：
小倉明彦
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は重点領域研究の公募研究などで単年度申請となっているが、実質は2年計画の初年度である。ある種の神経細胞に高濃度に発現している可溶性カルシウム結合蛋白質の生理的意義を解明することを目的とし、全体として(1)COS-7細胞へのhippocalcin(HIP)-cDNAの導入・発現、(2)導入細胞と非導入細胞との細胞内カルシウムイオン(Ca)動態の差の検討、(3)部分的に改変した変異HIP遺伝子の導入・発現とCa動態の比較、(4)培養神経細胞へのHIPの導入・過剰発現、(5)導入細胞のグルタミン酸毒性抵抗性の変化検討、という計画を立て、平成7年度においては(1)(2)(3)を行う予定であった。さて、(1)についてはSV40系のコスミドベクターにHIP-cDNAを組み込み、DEAE-dextran法によって一過的発現を図って成功した。これを用いて(2)の検討に移り、ionomycinによって細胞内Ca濃度を強制的に上げた後の回復速度、すなわちCa排出能が、発現細胞で高まっていることを見出した。一般に神経細胞などの非増殖性の細胞への外来遺伝子の導入・発現は困難とされているが、(4)を行うためにはこれを克服する必要がある。その導入系としてアデノウイルスベクター系に着目して基礎検討を開始した。CAGプロモーターを用い、導入外来遺伝子としてクラゲ由来の緑色蛍光蛋白(GEP)遺伝子を組み込んだウィルス粒子を感染させたところ、24時間以内に細胞が蛍光を発し、導入遺伝子の発現が確認された。現在はGFPに代わってHIPおよびHIP-GFPキメラを組み込んだベクターを作成中である。これを作成次第、(5)の検討に移る予定である。本年度は(4)を優先させたため(3)は未着手であるが、現在HIPのどのドメインに変異を導入すべきか検討中である。

这项研究适用于一年的关键领域公开招募研究，但这本质上是两年计划的第一年。目的是阐明某些神经元中高浓度以高浓度表达的可溶性钙结合蛋白的生理意义，该计划是（1）介绍并表达COS-7细胞中的河马（hip） - cDNA，（2）在跨核钙离子（CA）Kinetics之间的一部分和非近离子（CA）的介绍（CA）的差异（2））（2）（2）突变的髋关节基因和Ca动力学，（4）将髋关节引入并过表达髋关节，（5）检查转导细胞中谷氨酸毒性抗性的变化。 1995年，（1），（2），（3）。现在，关于（1），将嘻哈纳入SV40系统的宇宙矢量中，并使用DEAE-DEXTRAN方法实现了瞬态表达。使用此过程，我们在（2）中移动了研究，发现在表达细胞中，恢复速率（即通过离子霉素强行增加细胞内Ca浓度的能力）增加了。通常认为很难将外源基因引入和表达非增殖性细胞（例如神经元），但是必须克服这才能执行（4）。基础研究已经开始关注腺病毒媒介系统作为引入系统。当使用CAG启动子感染一种病毒颗粒，该病毒颗粒从水母中掺入绿色荧光蛋白（GEP）基因作为外源基因时，这些细胞在24小时内发出荧光，证实了持光烯的表达。当前，正在制作结合髋关节和嘻哈-GFP嵌合体的向量代替GFP。一旦创建了这一点，我们计划继续考虑（5）。由于（4）在今年被优先（3）尚未进行，但我们目前正在考虑哪个髋关节领域引入突变。