アミド結合の形成を触媒するリガーゼの立体構造と反応の制御

催化酰胺键形成的连接酶的三维结构和反应的控制

• 批准号: 07280210
• 负责人: 西岡 孝明
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280210/
• 关键词: リガーゼ; X線結晶構造解析; 立体構造比較; 2次構造要素; 立体構造トポロジー

反応至適条件であるpH7.5で結晶化したグルタチオン合成酵素の立体構造を決定し、それをpH6の立体構造と比較した。分子全体として比較すると2つの構造で主鎖のfoldや2次構造要素にほとんど違いはみられなかった。しかし、それぞれの構造でCα-Cα原子間の距離を計算し、2つの構造でそれらの差をプロット(difference distance plot)すると、pH7.5では3つのドメイン(N-末端、中央、C-末端ドメイン)のうち中央ドメインだけが、局所的に主鎖が少しずれたり、ドメイン全体が剛体(rigid body)としてN-末端ドメインのほうへ移動(domain movement)していることがわかった。グルタチオン合成酵素の3つのドメインはいずれもβ-sheetとα-helixから構成されており、N-末端ドメインは平行β-sheetから、中央とC-末端ドメインは逆平行β-sheetからできている。このような主鎖のfoldの組み合わせは他の蛋白質に見られない珍しいものである。ところでドメインが蛋白質の構成単位であるとすれば、これらに類似したドメインが他の蛋白質にも存在しているのかどうか、また、それが酵素機能の単位であるのかどうか調べるために、至適条件下のグルタチオン合成酵素の構造をこれまでに知られている294個の蛋白質の立体構造と比較し、類似性を探した。構造比較には2次構造要素の空間配置の類似性を検出するアルゴリズムCOSEC(Mizuguchi & Go 1995)を用いた。その結果、ドメイン2つ以上にわたって、極めて高い類似性をしめした蛋白質はD-alanine:D-alanine ligase,succinyl-CoA synthetase β-subunit,acetyl-CoA synthetase biotin-carboxylase subunitの3つであった。いずれもグルタチオン合成酵素のATP-結合サイトの立体構造と類似性を示し、2次構造要素のアミノ酸配列上での順番(topology)も同じであった。さらにこれら4つの酵素が触媒する反応ではいずれも、ATPとカルボン酸を基質としてアシルリン酸中間体を経て反応することが確認あるいは推定されている。このような構造および機能の共通性から、4つの酵素は共通の祖先から進化してきたものと推定される。しかし、ATP結合ドメインが逆平行β-sheetで構築されているprotein kinase CなどのATP関連蛋白質とは立体構造の有意な類似性はみとめられなかった。

确定了在pH 7.5（最佳反应条件）结晶的谷胱甘肽合酶的空间结构，并确定空间结构与pH 6的空间结构进行比较。当比较整个分子时，折叠和两个结构之间的主链的次级结构元素之间几乎没有差异。但是，当计算每种结构的Cα-Cα原子之间的距离并在两个结构上绘制它们之间的差异时，发现在pH 7.5处，在这三个域（N端，中心和C端域）中，只有中心域在主链中局部稍微移动，整个域中朝着N-termain tenterus domain s an-termain as a in ridain as n ridain as n ridain。谷胱甘肽合酶的所有三个结构域均由β-折叠和α-螺旋组成，N末端结构域由平行的β-折叠组成，中央和C末端结构域由抗皮平行的β-片组成。这种主链褶皱组合很少见，在其他蛋白质中找不到。如果该结构域是蛋白质的结构单位，那么要研究其他蛋白质中是否存在类似的结构域以及它是否是酶功能的单位，我们将谷胱甘肽合酶在最佳条件下的结构与294个已知蛋白质的三维结构与294个已知蛋白质的三维结构进行了比较。为了进行结构比较，使用了一种检测次级结构元素空间排列相似性的算法COSEC（Mizuguchi＆Go 1995）。结果，在两个或多个结构域中具有极高相似性的三种蛋白质是D-丙氨酸：D-丙氨酸连接酶，琥珀酰-COA合成酶β-亚基蛋白和乙酰基-COA合成酶生物素 - 羧化酶亚基。两者都显示出与谷胱甘肽合酶ATP结合位点的空间结构相似，并且氨基酸序列上二级结构元素的拓扑结构相同。此外，已经证实或假定在所有四种酶催化反应中，ATP和羧酸都是使用AS底物通过磷酸盐中间体反应的。结构和功能的这种共同点表明，四种酶是从一个共同的祖先演变而来的。然而，与ATP相关蛋白（如蛋白激酶C）没有观察到明显的构象相似性，其中ATP结合结构域是用反平行的β-折叠构建的。