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ラット小脳一酸化窒素合成酵素の連続反応の解析

大鼠小脑一氧化氮合酶序贯反应分析

基本信息

批准号：
08249227
负责人：
小南思郎
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08249227/
关键词：
一酸化窒素合成酵素 nNOS 大腸菌ラット小脳大量発現連続反応

项目摘要

一酸化窒素合成酵素(NOS)はアルギニンを基質として中間代謝物水酸化アルギニンを生成し、最終的にシトルリンとNOを合成する。この中間生成物はNOSから解離することなく連続的に代謝されると言われているが、その確定的証拠はない。反応機構の解析に必要とされる多量の精製酵素を臓器から分離精製することは困難であるため、大腸菌を用いたNOSタンパク質の大量発現系の構築から始めた。ラット小脳の一酸化窒素合成酵素(nNOS)のcDNAはジョンズ・ホプキンス大のSnyderから供与され、テキサス大のMastersの方法に従いpCWベクターに組み込み、デュポンより供与されたシャペロニンの遺伝子をもつpELSとともに大腸菌BL21を形質転換した。nNOSを発現する条件を検討した結果、IPTGで誘導後25C、40時間の培養により培養液1リットル当り250nmolのnNOSが発現することが分かった。この培養液からDEAE陽イオン交換及び2'、5'ADP分子親和性クロマトグラフィーによりnNOSを精製した。SDS-PAGEで単一バンドになるまでnNOSは精製できたがその収率は10%と低かった。しかし、そのシトルリン合成活性は450nmol/min/nmolNOSと報告されている最高値に近い値を示した。収率を上げるため、nNOSのC-末端にHisを4つ持つnNOSのcDNAをPCR法により構築した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、Niキレートカラムを用いて精製を試みたが、収率の改善はなく、その最終精製標はシトルリン合成活性が50nmol/min/nmolNOSしかなかった。これはC-末端にHisを付加することは活性に影響を与えることを示している。

An enzyme for the synthesis of nitric oxide (NOS), an intermediate metabolite, produces nitric oxide (NO). The intermediate product is dissociated from the product and the product is metabolized. The analysis of the reaction mechanism is necessary for the construction of a large number of purification enzymes. The cDNA sequence of nNOS gene was transformed into pELS gene and transformed into E. coli BL21 gene. The conditions for nNOS production were investigated. After induction with IPTG at 25C and 40 h, the culture medium was incubated for 1 h until 250nmol of nNOS was produced. The culture medium was purified by DEAE cation exchange and 2'and 5'ADP molecular affinity. SDS-PAGE was performed at a rate of 10%. The highest value reported in the study was 450nmol/min/nmol NOS. C-terminal of nNOS gene was constructed by PCR. The activity of E. coli production, purification and purification was 50nmol/min/nmolNOS. The C-terminal part of the cell is activated.