ラット小脳一酸化窒素合成酵素の連続反応の解析

大鼠小脑一氧化氮合酶序贯反应分析

基本信息

批准号：
11116221
负责人：
小南思郎
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

NOSはP450とそのヘム鉄の配位子場が非常によくにているため、P450と類似のEPRシグナルを酸化型で示す。酸化型ヘム鉄に結合したNOはEPR吸収を示さないが、極低温で可視光照射をすると鉄からNOが光解離し、その解離したNOがヘムの近辺に補足され特異なEPR吸収を示すことを、すでに阪大の堀らが報告している。NOSの場合、酵素自体がNOを発生するため、ヘム鉄とNOの関係を調べることは非常に重要である。酸化型NOSのNO複合体に極低温で可視光を照射して、そのEPRシグナルの消長を調べた。NOSに基質の結合していない状態では、光解離されたNOは4.2Kにおいてもヘム鉄の遠位領域でかなり自由に動き回り、その大部分が酸化型ヘム鉄と再結合する。基質あるいは生成物を結合したNOS中では、光解離されたNOのほとんどは、ヘムのすぐ近くにある基質あるいは生成物のグアニヂドあるいはウレイド基に補足されることが明らかとなった。この結果は、NOSの反応において生じたNOが一度シトルリンのウレイド基に補足されることを示唆している。25℃でNOSの1回転の反応を測定した場合、基質であるArgが約50ミリ秒の半減期で対数的に減少し、その減少に伴いOHArgの増大が観測できた。OHArgは約100ミリ秒で最大となり、それに続く減少に伴いCitが生成してきた。この実験によりはじめてOHArgがNOSの反応の中間代謝物であることが実証された。反応迅速停止法により求められた速度定数はアレニウスの式に従う温度依存性を示した。ArgとOHArgの水酸化反応の活性化エネルギーとOHArgの解離の活性化エネルギーは12-15kcal/molとほぼ等しいが、最終生成物Citの解離の活性化エネルギーは25kcal/molと他の段階の2倍近い。これはNOSの反応においては、Citの解離が律速段階になることを意味する。

NOS表现出类似于P450的氧化EPR信号，作为其P450的配体场及其血红素铁。尽管与氧化的血红素铁无结合并未表现出EPR吸收，但它已经报道说，在极低的温度下暴露于可见光时，没有来自铁的光解离，并且在血红素附近没有补充物并表现出独特的EPR吸收。就NOS而言，酶本身会产生NO，因此研究血红素铁与NO之间的关系非常重要。在极低的温度下，用可见光照射了无氧化的NOS的NO复合物，以确定EPR信号的程度。在未结合的基板上，在血红素铁的远端区域，即使在4.2K处，光解散的无动作也完全自由地移动，其中大部分将其与氧化的血红素铁重组。已经显示的是，在具有底物或产品附加的NOS中，大多数光分解的NO都补充了底物或近距离近距离血红素的鸟翼或尿素基团。该结果表明，NOS反应中未产生的一度被补充到瓜氨酸乌雷多组。当在25°C下测量单个NOS的单个旋转时，底物ARG以大约50毫秒的半衰期降低对数，并且在观察到降低时可以观察到Oharg的增加。 Oharg在约100毫秒内的最大值，随后下降，CIT产生。该实验首次证明了oharg是NOS反应中的跨代谢物。通过快速反应停止方法确定的速率常数显示了根据Arrhenius方程的温度依赖性。 Arg和Oharg之间羟基化反应的活化能以及Oharg解离的活化能大约等于12-15 kcal/mol，但是最终产物CIT分离的激活能量为25 kcal/mol，几乎是其他阶段的两倍。这意味着在NOS反应中，CIT的解离是限制步骤。