ラット小脳一酸化窒素合成酵素の連続反応の解析

大鼠小脑一氧化氮合酶序贯反应分析

• 批准号: 11116221
• 负责人: 小南 思郎
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11116221/
• 关键词: 一酸化窒素; 一酸化窒素合成酵素; EPR; ヘム鉄; 反応迅速停止法; 連続反応; 活性化エネルギー

NOSはP450とそのヘム鉄の配位子場が非常によくにているため、P450と類似のEPRシグナルを酸化型で示す。酸化型ヘム鉄に結合したNOはEPR吸収を示さないが、極低温で可視光照射をすると鉄からNOが光解離し、その解離したNOがヘムの近辺に補足され特異なEPR吸収を示すことを、すでに阪大の堀らが報告している。NOSの場合、酵素自体がNOを発生するため、ヘム鉄とNOの関係を調べることは非常に重要である。酸化型NOSのNO複合体に極低温で可視光を照射して、そのEPRシグナルの消長を調べた。NOSに基質の結合していない状態では、光解離されたNOは4.2Kにおいてもヘム鉄の遠位領域でかなり自由に動き回り、その大部分が酸化型ヘム鉄と再結合する。基質あるいは生成物を結合したNOS中では、光解離されたNOのほとんどは、ヘムのすぐ近くにある基質あるいは生成物のグアニヂドあるいはウレイド基に補足されることが明らかとなった。この結果は、NOSの反応において生じたNOが一度シトルリンのウレイド基に補足されることを示唆している。25℃でNOSの1回転の反応を測定した場合、基質であるArgが約50ミリ秒の半減期で対数的に減少し、その減少に伴いOHArgの増大が観測できた。OHArgは約100ミリ秒で最大となり、それに続く減少に伴いCitが生成してきた。この実験によりはじめてOHArgがNOSの反応の中間代謝物であることが実証された。反応迅速停止法により求められた速度定数はアレニウスの式に従う温度依存性を示した。ArgとOHArgの水酸化反応の活性化エネルギーとOHArgの解離の活性化エネルギーは12-15kcal/molとほぼ等しいが、最終生成物Citの解離の活性化エネルギーは25kcal/molと他の段階の2倍近い。これはNOSの反応においては、Citの解離が律速段階になることを意味する。

NOS は P450 と そ の ヘ ム iron objects の ligand field が very に よ く に て い る た め, P450 と similar の EPR シ グ ナ ル を acidification model で す. Acidification model ヘ ム iron objects に combining し た NO は EPR suction 収 を shown さ な い が, extremely low temperature で visible light irradiation を す る と iron objects か ら NO が photolysis し, そ の dissociation し た NO が ヘ ム の nearly 辺 に complement さ れ specific な EPR suction 収 を shown す こ と を, す で に e. big の Mr ら が report し て い る. NOS の occasions, enzyme autologous が NO を 発 raw す る た め, ヘ ム iron objects と NO の masato is を adjustable べ る こ と は very important で に あ る. Acidified NOS and <s:1> NO complex に extremely low temperature で visible light を irradiation <s:1> て, そ <s:1> EPRシグナ シグナ を を waxing and waning を べた べた. NOS の に matrix combining し て い な い state で は, photolysis さ れ た NO は 4.2 K に お い て も ヘ ム iron objects の far a field で か な り free に き り back, そ の type most が acidification ヘ ム iron objects と combining す る. Matrix あ る い は products を combining し た NOS in で は, photolysis さ れ た NO の ほ と ん ど は, ヘ ム の す ぐ nearly く に あ る matrix あ る い は products の グ ア ニ ヂ ド あ る い は ウ レ イ ド base に complement さ れ る こ と が Ming ら か と な っ た. こ の results は, NOS の 応 に お い て raw じ た NO が once シ ト ル リ ン の ウ レ イ ド base に complement さ れ る こ と を in stopping し て い る. 25 ℃ で NOS の 1 back planning の anti 応 を determination し た occasions, matrix で あ る Arg が about 50 ミ の リ second half life で に to reduce the number of seaborne し, そ の reduce に with い OHArg の raised large が 観 measuring で き た. OHArg で approximately 100 <s:1> リ seconds で maximum とな た それに続く それに続く decrease に accompanied by が Citが generation て て た た た た. <s:1> empirical evidence によ じめて じめてOHArgがNOS <s:1> anti応 <s:1> intermediate metabolites である とが とが empirical evidence された. The reverse 応 rapid stop method によ extinction is used to find the められた velocity fixative, and the アレニウス アレニウス <s:1> formula に従う temperature dependence を shows the た た. Arg と OHArg の water acidification anti 応 の activeness エ ネ ル ギ ー と OHArg の dissociation の activeness エ ネ ル ギ ー は 12-15 kcal/mol と ほ ぼ etc し い が の activeness, final products Cit の dissociation エ ネ ル ギ ー は 25 kcal/mol と he の Duan Jie nearly い の 2 times. The <s:1> れ て NOS <s:1> inverse 応にお て て <e:1> and Cit <s:1> dissociation が law speed order になる とを とを とを imply する.

项目成果

S.Kominami et al.: "Molecular Steroidogenesis (edited by M. Okamoto et al.)"The regulation of successive reactions catalyzed by P45011β and P45017α. 4 (1999)

S. Kominami 等人：“分子类固醇生成（M. Okamoto 等人编辑）”P45011β 和 P45017α 催化的连续反应的调节4 (1999)。

S.Kominami et al.: "EPR Studies on the Photo-induced Intermediates of Ferric NO Complexes of Rat Neuronal Nitric Oxide Synthase trapped at Low Temperature"Journal of Biochemistry. 126. 756-761 (1999)

S.Kominami等人：“低温下捕获的大鼠神经元一氧化氮合酶的光诱导铁NO复合物中间体的EPR研究”生物化学杂志。

M.Takase et al.: "Pregnenolone, pregnenolone sulfate, and cytochorme P450 side-chain cleavage enzyme in the amphibian brain and their seasonal changes"Endocrinology. 140. 1936-1944 (1999)

M.Takase 等人：“两栖动物大脑中的孕烯醇酮、硫酸孕烯醇酮和细胞色素 P450 侧链裂解酶及其季节变化”内分泌学。

T.Iwanaga et al.: "Kinetic studies on the Successive Reaction of Neuronal Nitric Oxide Synthase from L-Arginine to Nitric Oxide and Citrulline"Biochemistry. 38. 16629-16635 (1999)

T.Iwanaga 等人：“神经元一氧化氮合酶从 L-精氨酸到一氧化氮和瓜氨酸连续反应的动力学研究”生物化学。

T.Yamazaki et al.: "Molecular Steroidogenesis (edited by M. Okamoto et al.)"Steroidogenesis Acute Regulatory (StAR) proteins Expression is Regulated by Ca in Bovine Adrenal Fasciculta-Reticularis Cells. 2 (1999)

T.Yamazaki 等人：“分子类固醇生成（由 M.Okamoto 等人编辑）”类固醇生成急性调节 (StAR) 蛋白的表达由牛肾上腺束状网状细胞中的 Ca 调节。