末端酸化酵素の基質酸化特異性とプロトンポンプにおける金属活性中心の役割

大腸菌のbo型キノールオキシダーゼのサブユニットIIの親水性ドメインを好熱性バシラスPS3のcaa_3型シトクロムオキシダーゼのサブユニットIIの対応する親水性ドメイン(Cu_A領域とシトクロムc領域を含む)に導入するために、bo型キノールオキシダーゼの全構造遺伝子を含むpCM13を構築した。このプラスミドを用いてbo型オキシダーゼを欠く大腸菌の株に形質転換したところ0.01〜0.02nモル/mg膜蛋白質程度のキメラ酵素の発現があった。bo型とbd型双方のオキシダーゼを欠く大腸菌の株に導入したところ、0.1〜0.2nモル/mg膜蛋白質の発現があったが、形質導入の効率は低かった。形質転換体の膜の酵素活性、PS3シトクロムオキシダーゼのサブユニットIIに対する抗体を利用したWestern分析、ヘムcの存在によって目的のキメラ酵素が確かに発現されていることを確かめることが出来た。すなわち、キメラ酵素はシトクロムcオキシダーゼ活性とキノールオキシダーゼ活性の両方を持っていた。一方同様の遺伝子の入れ換えに加えて、サブユニットIIとサブユニットIの間のストップコドンをなくし、融合蛋白質を作るようにデザインしたpCM14により形質転換した菌の膜の解析を行ったが、この場合はキメラ酵素の発現は確認できなかった。

大腸菌のbo型キノールオキシダーゼのサブユニットIIの親水性ドメインを好熱性バシラスPS3のcaa_3型シトクロムオキシダーゼのサブユニットIIの対応する親水性ドメイン(Cu_A領域とシトクロムc領域を含む)に導入するために、bo型キノールオキシダーゼの全構造遺伝子を含むpCM13を構築した。このプラスミドを用いてbo型オキシダーゼを欠く大腸菌の株に形質転換したところ0.01〜0.02nモル/mg膜蛋白質程度のキメラ酵素の発現があった。bo型とbd型双方のオキシダーゼを欠く大腸菌の株に導入したところ、0.1〜0.2nモル/mg膜蛋白質の発現があったが、形質導入の効率は低かった。形質転換体の膜の酵素活性、PS3シトクロムオキシダーゼのサブユニットIIに対する抗体を利用したWestern分析、ヘムcの存在によって目的のキメラ酵素が確かに発現されていることを確かめることが出来た。すなわち、キメラ酵素はシトクロムcオキシダーゼ活性とキノールオキシダーゼ活性の両方を持っていた。一方同様の遺伝子の入れ換えに加えて、サブユニットIIとサブユニットIの間のストップコドンをなくし、融合蛋白質を作るようにデザインしたpCM14により形質転換した菌の膜の解析を行ったが、この場合はキメラ酵素の発現は確認できなかった。