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イオン駆動型トランスポーターの構造と機能に関する比較研究

离子驱动转运蛋白结构与功能的比较研究

基本信息

批准号：
08268250
负责人：
三木俊明
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ポリアミン輸送体、UDP-ガラクトース輸送体、Na^+/H^+アンチポーターについて次の研究成果を得た。1.UDP-ガラクトース輸送体(UGT)のクローニングと解析:マウスFM3A細胞の変異株Had-1細胞は、UGTを欠損する。我々は、この欠損の相補を指標として、alternative splicingによる生じた2種類の異なるUGTのcDNAを単離することに成功した。その結果、UGT2には396アミノ酸残基のORFが存在するが388番目のLysまでの配列はUGT1,UGT2に共通であり、C末端部分の数残基および3'UTR部分の配列のみが両者で異なることが明らかになった。UGTcDNAの発現実験を行ったところ、UGT1,2をHad-2細胞に導入して得られたtransformantはいずれも、Had-1のUGT欠損が相補されていることが示された。UGT1,2のそれぞれに特異的なペプチド抗体を用いた解析から、Had-1細胞中にはUGT産物が検出されないこと、Had-1/UGT1細胞中にはUGT1産物、Had-1/UGT2細胞中にはUGT2産物がそれぞれ発現していること、親株FM3A細胞中には抗UGT2抗体と交叉反応を示すタンパク質が存在することがそれぞれ明らかになった。以上の結果に基づいて我々は、8回膜貫通型の推定構造をもつUGT1,UGT2はUDP-ガラクトース輸送体の本体であると結論した。2.ポリアミン輸送系の検討:メンブランフィルター上で培養し、側底膜と頂端膜に分化した単層シートを形成させた腎尿細管由来のLLC-PK_1細胞を用いて、ポリアミンの輸送系について検討を行った。遊離ポリアミンの取り込みに関して、この細胞は側底膜側にも1種類、頂端膜側には高親和性および低親和性の2種類のポリアミン輸送系にもつことが明らかになった。ポリアミンの取り込みに関する競合実験の結果は、これらの輸送体がいずれもポリアミンのうちプトレシン(Put),スペルミジン(Spd),スペルミン(Spm)を輸送する能力を持つことを示している。現在までのところこの細胞には、特定のポリアミン骨格に特異的な輸送体は見出されていない。原尿中のポリアミンの再吸収に関与すると考えられる頂端膜側のポリアミン輸送系の性質についてさらに検討した結果、モノアセチルスペルミンがSpdの取り込みと競合しつつ,Spd輸送系を経由して実際に細胞内に取り込まれることが示された。これに対してジアセチルスペルミンはSpdの取り込みと競合しないだけでなく、頂端膜側からは全く細胞内に取り込まれないことが明らかになった。3.Na^+/H^+アンチポーター(NHE):ウシ腎臓の上皮組織におけるNHEの局在性について、NHE1,NHE3isoformに対するペプチド抗体を用いて検討したところ、NHE1は側底膜に、NHE3は刷子縁膜に局在することが明らかになった。

ポリアミン transport body, UDP-ガラクトース transport body, Na^+/H^+アンチポーターについて时の research results are obtained. 1. Analysis of the UDP-Glucotransporter (UGT): The FM3A cells are different strains of Had-1 cells, and the UGTs are damaged. I am 々は, この deficiency の complement を index として, alternative splicing による生じた 2 kinds ののなるUGT の cDNA を単出することにした.そのResults, UGT2's 396 アミノ acid residue のORF's existence するが388's のLys までのalignment はUGT1,U GT2 has a common sequence of residues and a sequence of residues in the C-terminal part of the 3'UTR part. UGTcDNA has been introduced into Had-2 cells, and it has been introduced into Had-2 cells. ransformantはいずれも、Had-1のUGT lacks and compensates for the lack of it. UGT1,2 specific NTD antibody is analyzed by UGT1, and it is analyzed in Had-1 cells UGT product が検出されないこと, にはUGT1 product in Had-1/UGT1 cells, Had- 1/The UGT2 product is present in UGT2 cells, and the parent strain FM3A cells are present Anti-UGT2 antibodies and cross-reactions indicate the presence of anti-UGT2 antibodies. The above results are based on the estimated structure of the 8-circuit film penetration type UGT1 and UGT2, and the main body of the conveyor body is concluded. 2. The use of the ポリアミン transport system: メンブランフィルター upper culture, lateral bottom membrane and apical membrane differentiation した単layer and シートThe LLC-PK_1 cells that form the kidney and urinary tubules are used in the transport system of the kidney and urine. Free ポリアミンのGET り込みに关して, このcell は side basal membrane side にも 1 type, apical membrane side にはHigh affinity および low affinity 2 types of のポリアミン delivery system にもつことが明らかになった.ポリアミンのGETり込みに关する同合実験のRESULTは、これらの Transportation Bodyン(Put), スペルミジン(Spd), スペルミン(Spm)をTransportation ability をhold つことを Show している. Nowadays, there are no cells, specific nouns, and special transporters. The reabsorption of the original urine and the apical membrane side of the testのポリアミン conveyance system's nature についてさらに検した results, モノSpd The transport system is carried out through the intracellular transport system.これに対してジアセチルスペルミンはSpdの取り込みと合合しないだけでなく, apical membrane side からは full く intracellular に take り込まれないことが明らかになった. 3.Na^+/H^+アンチポーター(NHE): NHE1, NHE3iso formに対するペプチドantibodiesを用いて検柁たところ、NHE1 The bottom film on the side and the brush film on NHE3 are all in the same place.