重水素パルスラベル法によるリゾチーム構造形成過程の詳細解析

氘脉冲标记法详细分析溶菌酶结构形成过程

• 批准号: 08272232
• 负责人: 瀬川 新一
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kwansei Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272232/
• 关键词: 蛋白質の折りたたみ; NMR; リゾチーム; 重水素交換反応; 構造形成

リゾチームの主鎖の折畳み過程を観測するために、主鎖アミドプロトンの重水素交換反応と2次元NMR分光法を用いた。あらかじめ完全に重水素化したリゾチームを作製し、これを6M塩酸グアニジン(GuHCl)中に溶解してランダム構造をとらせ、次ぎにこの溶液を軽水で希釈して蛋白質の折畳み反応を開始させた(pH3.0、1.5MGuHCl、25℃)。適当な折畳み反応時間経過後(τ_f)、パルス的に溶液のpHを6.8に上げ再び3.0に戻す。この操作でUnfoldしている主鎖のNHプロトンの軽水素化がパルス的に許されるため、パルスラベル法と呼ばれている(パルス幅約0.5s)。この結果、速く構造形成した部分はパルスラベル交換がプロテクトされ、遅い部分はプロテクトされずにNDがNHに交換される。このサンプルの2次元NMR(COSY)スペクトルを測定すると、折畳み反応の進行の遅い部分が残基レベルの分解能で同定される。τ_fを変えてパルスラベルすると、原子レベルの分解能で折畳み過程の時間変化を追跡することが可能である。パルスラベルの実験には、高速混合反応を連続して3回行う必要があり、ユニソク製のケミカルクェンチミキサ-が用いられた。上記の溶液条件下で、リゾチームの折畳み速度の平均値は円偏光楕円率の時間変化の測定から約6.0sであった。一方、τ_fを1.0sから30sの範囲で変えてパルスラベルしたサンプルのNMR観測の結果から、各残基毎の折畳み速度定数が決定された。リゾチームαドメインのAヘリックスとBヘリックスのアミドプロトンの折畳み速度は、平均値より速く約2.4から4.0sであるが、βドメインのシート構造では、平均値より遅く約8.7から12.7sであった。現在、温度を変えながらこの実験を継続している。一方、リゾチーム主鎖がほどける反応(Unfolding)の速度定数も、GuHCl4.0M、pH3.3、温度20℃で行っている。

リ ゾ チ ー ム の master lock の fold 畳 み process を 観 measuring す る た め に, main lock ア ミ ド プ ロ ト ン の heavy water element exchange the 応 と 2 dimensional NMR spectrometry を with い た. あ ら か じ め に heavy water element is changed completely し た リ ゾ チ ー ム を as し, こ れ を 6 m salt acid グ ア ニ ジ ン (GuHCl) し に dissolve て ラ ン ダ ム tectonic を と ら せ, ぎ に こ の solution を 軽 water で bush 釈 し の て protein folding 畳 み anti 応 を began さ せ た (pH3.0, 1.5 MGuHCl, 25 ℃). After appropriate な fold 畳 み 応 time 経 (tau _f), パ ル ス の に solution pH 6.8 に を げ び again on 3.0 に 戻 す. こ の で operation Unfold し て い る master lock の NH プ ロ ト ン の 軽 water element change が パ ル ス に xu さ れ る た め, パ ル ス ラ ベ と ル method called ば れ て い る (パ ル ス about 0.5 s). こ の results, speed く し structure formation た part は パ ル ス ラ ベ ル exchange が プ ロ テ ク ト さ れ, 遅 い part は プ ロ テ ク ト さ れ ず に ND が NH に exchange さ れ る. こ の サ ン プ ル の 2 dimensional NMR (COSY) ス ペ ク ト ル を determination す る と, folding 畳 み anti 応 の for の 遅 い part が residues レ ベ ル の can decompose で with fixed さ れ る. Tau _f を - え て パ ル ス ラ ベ ル す る と, atomic レ ベ ル の can decompose で discount 畳 の み process time - the を tracing す る こ と が may で あ る. パ ル ス ラ ベ ル の be 験 に は, high-speed mixing anti 応 を even 続 し て 3 return う necessary が あ り, ユ ニ ソ ク system の ケ ミ カ ル ク ェ ン チ ミ キ サ - が use い ら れ た. Written の solution under the condition of で, リ ゾ チ ー ム の fold 畳 の み speed on average numerical は has drifted back towards &yen; polarized 楕 の has drifted back towards &yen; rate of time - the の determination か ら about 6.0 s で あ っ た. Side, tau _f を 1.0 s か ら 30 s の van 囲 で - え て パ ル ス ラ ベ ル し た サ ン プ ル の NMR 観 の measurement results か ら, various residues in their の fold 畳 み speed constant が decided さ れ た. リ ゾ チ ー ム alpha ド メ イ ン の A ヘ リ ッ ク ス と B ヘ リ ッ ク ス の ア ミ ド プ ロ ト ン の fold 畳 は み speed, average numerical よ く り speed is about 2.4 か ら 4.0 s で あ る が, beta ド メ イ ン の シ ー ト tectonic で は, average numerical よ り 遅 く 8.7 か ら 12.7 s で あ っ た. Now, the temperature を changes to えながら て <s:1> experiment を継続 て る る. Party, リ ゾ チ ー ム master lock が ほ ど け る anti 応 (Unfolding) の speed constant も, GuHCl4.0 M, pH3.3, temperature 20 ℃ で line っ て い る.

项目成果

Hamada,Daizo: "Non-native α-helical intermediate in the refolding of β-lactoglobulin,a predominantly β-sheet protein" Nature Structural Biology. 3. 868-873 (1996)

Hamada, Daizo：“β-乳球蛋白（主要是 β-折叠蛋白）重折叠中的非天然 α-螺旋中间体”《自然结构生物学》3. 868-873 (1996)。

Noda, Yasuo: "A Two-Dimensional NMR Study of Exchange Behavior of Amide Hydrogens in a Lysozyme Derivative with an Extra Cross-Link Between Glu35 and Trp108-Quenching of Cooperative Fluctuations and Effects on the Protein Stability" Biopolymers. 41. 131-1

Noda、Yasuo：“溶菌酶衍生物中酰胺氢交换行为的二维 NMR 研究，其中 Glu35 和 Trp108 之间有额外的交联——协同波动的淬灭以及对蛋白质稳定性的影响”生物聚合物。