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G蛋白質共役型受容体ロドプシンの光反応過程のX線結晶構造解析

G蛋白偶联受体视紫红质光反应过程的X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
13033021
负责人：
七田芳則
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ロドプシンが光を受容するとG蛋白質(トランスデューシン)を活性化するようになるが、この過程で起こる蛋白質部分の構造変化を原子レベルで解析することを試みた。そのため、ロドプシンが活性状態に変化する過程で生成する4つの反応中間体について、X線回折データの収集を行い、それらのデータの解析を行った。また、初期中間体では蛋白質部分の大きな構造変化は起こらないので、データの精密化の基礎となるウシロドプシンの3次元結晶の品質を上げる努力を行った。昨年度我々はウシロドプシンの結晶化条件の再検討・基底状態構造の精密化を行った結果、2.6Åの分解能でロドプシンの立体構造を解析し、7つの水分子の同定に成功した。本年度は結晶化条件のさらなる検討を行い、分解能が向上した回折像の獲得に成功した。さらに種々の結晶化条件を検討して、この分解能を上げる努力を行った。また、培養細胞系でウシロドプシンを発現させ、抗体カラムを用いた精製法を適用することにより、結晶化に適した試料を調製することに成功した。また、その結晶化を試みた結果、結晶化する条件を見つけることができた。また、構成的活性化を示す(Constitutive Activeな)ロドプシン変異体について、その培養細胞系での発現・精製にも成功し、結晶化の条件を探索した。さらに、結晶化のための大量の試料を調製するために、ロドプシン変異体遺伝子を導入したStable Cell Lineを作製した。

The process of activation of G protein by light absorption starts with the structural transformation of protein parts and ends with atomic analysis. The reaction intermediates are generated during the reaction process, X-ray reflection data collection is performed, and the analysis of the reaction intermediates is performed. The structure of the protein part of the initial intermediate is changed, and the quality of the three-dimensional crystal is improved. Last year, we reexamined the crystallization conditions of the crystal, refined the structure of the substrate, analyzed the three-dimensional structure of the crystal by 2.6%, and successfully determined the water molecule by 7%. During the year, the crystallization conditions were investigated and the decomposition energy was successfully obtained. In this paper, the crystallization conditions of seed are discussed, and the decomposition energy is improved. The method of purification of antibody in culture cell line was successfully applied. Crystallization test results Crystallization conditions See below To explore the conditions for the development, purification and crystallization of various cell cultures. A large number of samples were prepared for crystallization, and Stable Cell lines were produced.