ファイトケラチン合成酵素の構造及び機能解析

植物螯合素合酶的结构和功能分析

• 批准号: 13033031
• 负责人: 日び 隆雄
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Fukui Prefectural University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033031/
• 关键词: ファイトレメディエーション; 重金属ストレス; 合成酵素; ファイトケラチン

植物においては、メタロチオネインの一種ファイトケラチンが重金属に対する生体防御の中心的な役割を果たしている。ファイトケラチンの合成を司どるファイトケラチン合成酵素(PCS)は、細胞内の重金属濃度に応じて活性化されることから、重金属濃度を感知する「センサー能」を持つと推定されている。本研究ではPCSの触媒機構ならびに活性化機構の解明を目標としており、今年度は発現系の改善を行うとともに、重金属センサーと予想されるC末端領域を系統的に欠損させた変異型PCSの作製および機能解析を行った。昨年度までに、蛋白質の構造形成に関わる分子シャペロン量を増加させた発現系で、PCSの可溶化発現を改善できることを示した。本年度は引き続き、PCSの大量調製を試みたが、プロテアーゼによる分解のためか、構造解析に必要な可溶性産物の供給が困難なことが判明した。そこで、プロテアーゼ遺伝子を欠損させた大腸菌宿主での発現を検討したところ、細胞質プロテアーゼLon、ClpP、HslUの3つを欠損させたW3110D Lon、ClpP、HslUにおいて、PCSの発現量が野生株W3110に比して10倍以上と、飛躍的に改善されることを確認した。次いで、重金属センサーとして機能すると予想されるPCSC末端を系統的に欠損させた変異体8種類(PCSΔC1,PCSΔC2,PCSΔC3,PCSΔC4,PCSΔC5,PCSΔC6,PCSΔC7,PCSΔC8)を作製し、W3110D Lon、ClpP、HslUにおける発現を確認した。C末端領域を全て欠損し、ファイトケラチン合成ドメインのみを持つ変異体(PCSΔC8)過剰発現株は、全長型PCS過剰発現株と同様にカドミウム耐性を獲得したことから、PCSΔC8にもファイトケラチン合成活性があると示唆された。PCS活性化におけるC末端領域の機能解析は今後の課題てある。一方、不溶性産物を形成しやすいPCS全長型と同様に、PCSΔC8も不溶化しやすいことが分かり、構造解析に適した試料調製のために、分子シャペロンを用いたPCSΔC8の可溶化、および蛋白質工学的手法によるPCSΔC8のフォールディング能の改善が、今後引き続き検討すべき課題であると考えている。

Plant に お い て は, メ タ ロ チ オ ネ イ ン の a フ ァ イ ト ケ ラ チ ン が heavy metal に す seaborne る raw body defense の な "を cut fruit た し て い る. フ ァ イ ト ケ ラ チ ン の synthetic を department ど る フ ァ イ ト ケ ラ チ ン synthetase (PCS) は, の heavy metal concentration in the cell に 応 じ て activeness さ れ る こ と か ら を perception, heavy metal concentration す る "セ ン サ ー can" を hold つ と presumption さ れ て い る. This study で は PCS の catalytic institutions な ら び に activeness institutions の interpret を target と し て お り, our は 発 line now is の improve を う と と も に, heavy metal セ ン サ ー と to think さ れ る を system in the domain of C terminal に owe loss さ せ た - different PCS の cropping お よ び line function analytical を っ た. Yesterday's annual ま で に, protein の に structure formation masato わ る molecular シ ャ ペ ロ ン in を raised add さ せ た 発 now で, PCS の solubilization 発 now を improve で き る こ と を shown し た. This year は lead き 続 き, PCS の large modulation を try み た が, プ ロ テ ア ー ゼ に よ る decomposition の た め か, tectonic analytical に の な soluble products supply necessary が difficult な こ と が.at し た. そ こ で, プ ロ テ ア ー ゼ heritage 伝 を son owe loss さ せ た coliform host で の 発 を now beg し 検 た と こ ろ, cytoplasmic プ ロ テ ア ー ゼ Lon, ClpP, HslU の 3 つ を owe loss さ せ た W3110D Lon, ClpP, HslU に お い て, PCS の 発 now quantity が wild strains W3110 に than し て 10 times more と, leap に improve さ れ る こ と を confirm し た. Time い で, heavy metal セ ン サ ー と し て function す る と to think さ れ る PCSC に owe loss of terminal を system さ せ た 1-8 species (PCS Δ C1, PCS Δ C2, PCS Δ C3, PCS Δ C4, PCS Δ C5, PCS Δ C6, PCS Δ C7, PCS Δ C8) を し, W3110D Lon, ClpP, HslUにおける occurrence を confirmation た. C terminal areas し を て owe all damage, フ ァ イ ト ケ ラ チ ン synthetic ド メ イ ン の み を hold つ - variants (PCS Δ C8) through turning 発 は strains, full-sized PCS now turning 発 と strains with others now に カ ド ミ ウ ム patience を get し た こ と か ら, PCS Δ C8 に も フ ァ イ ト ケ ラ チ ン synthetic activity が あ る と in stopping さ れ た. Analysis of <s:1> functions in the C-terminal domain of PCS activation における future <s:1> topics てある. One party, the insoluble product を formation し や す い PCS full-sized と with others に, PCS Δ C8 も don't melt し や す い こ と が points か り, tectonic analytical に optimum し た sample modulation の た め に, molecular シ ャ ペ ロ ン を with い た PCS Δ C8 の solubilization, お よ び protein engineering technique に よ る PCS Δ C8 の フ ォ ー ル デ ィ ン グ の improve が In the future, we will use 続 続 検 検 to discuss the すべ すべ topic であると and take the えて る る る.

项目成果

Kurokawa Y et al.: "Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase(DsbC)and its modulator(DsbD)markedly enhances periplasmic production of human nerve growth factor in Escherichia coli"J.Biol.Chem.. 276(17). 14393-14399 (2001)

Kurokawa Y等人：“细菌蛋白二硫键异构酶(DsbC)及其调节剂(DsbD)的过量产生显着增强了大肠杆菌中人神经生长因子周质的产生”J.Biol.Chem.. 276(17)。

J.Kohda: "Improvement of productivity of active form of glutamate racemase in Escherichia coli by coexpression of folding accessory proteins"Biochem. Eng. J.. 10. 39-45 (2002)

J.Kohda：“通过折叠辅助蛋白的共表达提高大肠杆菌中谷氨酸消旋酶活性形式的生产力”Biochem。

Y.Nishiya: "A Purification Method of the Diagnostic Enzyme Bacillus Uricase Using Magnetic Beads and Non-Specific Protease"Protein Expression and Purification. 25. 426-429 (2002)

Y.Nishiya：“使用磁珠和非特异性蛋白酶的诊断酶芽孢杆菌尿酸酶的纯化方法”蛋白质表达和纯化。

K.Hoshino: "Production of brain-derived neurotrophic factor in Escherichia coli by coexpression of Dsb proteins"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(2). 344-350 (2002)

K.Hoshino：“通过 Dsb 蛋白的共表达在大肠杆菌中生产脑源性神经营养因子”Biosci。

Takagi M et al.: "Cellular toxicity of cadmium ions and their detoxification by heavy metal-specific plant peptides, phytochelatins, expressed in Mammalian cells"J.Biochem.(Tokyo).. 131(2). 233-239 (2002)

Takagi M 等人：“镉离子的细胞毒性及其在哺乳动物细胞中表达的重金属特异性植物肽、植物螯合素的解毒作用”J.Biochem.（东京）.. 131(2)。