卵分化をモデルとした細胞の初期化機構の解析

以卵子分化为模型分析细胞重编程机制

基本信息

批准号：
15039223
负责人：
古野伸明
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15039223/
关键词：
アフリカツメガエル卵形成細胞周期幹細胞 Wee1 初期化 pre-MPF

项目摘要

究極の幹細胞は卵である。この事を考えると、細胞の初期化機構の研究とは、細胞がいかに卵に分化するかという問題へ還元される。卵細胞は、受精前後の特殊な細胞分裂を行うため、MosやWee1Aのように、卵特異的な母性由来の細胞周期調節因子を卵特異的に発現している。よってこれらの卵特異的なタンパク質の発生における発現調節機構の解明は、細胞の初期化機構の研究につながると考えられる。また、Mos, Wee1Aなどこれらの卵特異的なタンパク質は、受精後に一度消失し、再度卵特異的に発現してくる。今回、Wee1に焦点を絞り、1)発生におけるその卵特異的な発現を決めるプロモーター領域のクローニングと、2)発生のいつの段階から発現が始まるか、を解析した。1)に関しては、PCRでクローニングできるGenome Walking法で行っている。PCRでWee1Aの最初のメチオニンをコードする部分を含む約1kbpをクローニングして塩基配列を決定した所、5'の非翻訳領域が少なくとも2つのexsonにわかれている事が明らかになり、クローニングした1kbpの中に残念ながらプロモーター領域は入っていなかった。2)に関しては、whole mount in situ hybridization(WISH)法を用いて検出を試みた。通常良く使用されている頭部のマーカー(otx-2やXAG)などの発現を検出し、WISHが私の研究室でうまく行く事を確認した後、Wee1Aのプローブを用いてWISHを行った。この結果、RT-PCRの今までの報告、のう胚まで母性タイプが存在して、その後喪失する、と矛盾して、のう胚、神経胚、尾芽胚とシグナルが検出され、母性タイプがずっと残ってる可能性が示された。

最终的干细胞是卵。考虑到这一点，对细胞重编程机制的研究减少到细胞如何分化为卵的问题。由于卵细胞在受精之前和之后接受特殊的细胞分裂，因此它们是卵特异性母体细胞周期调节剂（例如MOS和WEE1A）的卵特异性表达。因此，人们认为在这些卵特异性蛋白的发展中阐明表达调节的机制将导致研究细胞重编程的机理。此外，这些卵特异性蛋白（如MOS和WEE1A）在受精后一次消失，并特别表达为卵。在这里，我们专注于WEE1，并分析了1）启动子区域的克隆决定了其发育中的卵特异性表达，以及2）发育的时期，以及在哪个发育阶段开始表达。关于1），它是使用基因组步行方法进行的，该方法可以由PCR克隆。在克隆大约1 kbp后，通过PCR克隆了WEE1A的第一个蛋氨酸编码部分以确定碱基序列，据显示，将5'未翻译的区域分为至少两个exos，不幸的是，启动子区域不包括在克隆的1 kbp中。关于2），尝试使用整个原位杂交（愿望）方法尝试检测。在检测到常用的头标记（OTX-2和XAG）的表达，并确认愿望在我的实验室中效果很好，愿望是使用WEE1A探针进行的。这一结果与过去的RT-PCR报道相矛盾，即使在SAC胚胎中也存在孕产妇类型，然后失去母体类型，诸如SAC胚胎，神经bryos和尾芽胚胎之类的信号被检测到，表明母体类型可能永远存在。