卵成熟におけるWee1翻訳調節の機構解析

卵母细胞成熟过程中Wee1翻译调控的机制分析

基本信息

批准号：
13043040
负责人：
古野伸明
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13043040/
关键词：
Wee1 翻訳調節アフリカツメガエル卵成熟 mRNA 非翻訳領域

项目摘要

内在性のWee1 mRNAは卵母細胞では翻訳されない。その翻訳抑制のcis elementを同定するため、まず全長のWee1 mRNAから3'UTRを欠失したmRNAを注入した。外から注入するWee1 mRNAには内在性のものと区別するためMyc tagをつけた。卵母細胞にmRNAを注入後、抗Myc抗体でWestern blottingを行い、注入されたmRNAが翻訳されたかどうか調べた。その結果、翻訳抑制が解除され、Wee1 mRAの3'UTRがWee1 mRNAの翻訳抑制に関与することがわかった。そのWee1の3'UTRには、サイクリンB1の翻訳抑制に関与するCPE配列が2ケ所と1ケ所のCPE様配列(以後CPELと呼ぶ)が存在するので、そのCPEがWee1の翻訳抑制にも関与しているかどうかを次に調べた。Wee1 mRNAの3'UTRの各種欠失変異体を作製しツメガエル卵母細胞に注入した。その結果、CPEの領域を欠失させると翻訳抑制が解除された。さらに、CPE, CPEL配列が関与することを確かめるため、そのCPE, CPELに点突然変異を導入して、そのWee1 mRNAの翻訳抑制されるか調べた所、翻訳抑制が解除された。これらの結果から、CPE、CPEL配列がWee1 mRNAの翻訳抑制に関与する配列であることがわかった。また、ツメガエルの卵母細胞に、3'UTRを持つWee1 mRNAを少量注入した時には翻訳されないが、大量に注入すると翻訳される。この結果は、Wee1 mRNAの3'UTRに結合するタンパク費が翻訳抑制に関与する事を示唆する。もしそうならば、Wee1 mRNAの3'UTRを大量に注入後に、本来翻訳抑制される3'UTRをもったWee1 mRNAを注入すると翻訳されはずである。この実験を行った所、予想どうり、本来翻訳抑制されるはずのWee1 mRNAが翻訳された。これらの結果から、卵母細胞に存在する何らかの因子がWee1 mRNAの3'UTRに結合して翻訳抑制していることが示唆された。

内源性WEE1 mRNA未在卵母细胞中翻译。为了识别其翻译抑制的顺式元素，首先从全长WEE1 mRNA注入3'UTR的mRNA。从外部注射的WEE1 mRNA被给予MYC标签，以将其与内源性区分开。将mRNA注入卵母细胞后，用抗MYC抗体进行蛋白质印迹，以确定是否翻译了注射的mRNA。结果表明，翻译抑制是放松管制的，WEE1 MRA的3'UTR参与了WEE1 mRNA的翻译抑制。在WEE1的3'UTR中，有两个CPE序列和一个类似CPE的序列（以下称为CPEL）参与了Cyclin B1的翻译抑制作用，因此我们接下来研究了CPE是否还参与WEE1翻译抑制作用。生成了WEE1 mRNA的3'UTR的各种缺失突变体，并将其注入异爪蟾卵母细胞。结果，删除CPE区域导致翻译抑制被消除。此外，为了确认涉及CPE和CPEL序列，将点突变引入了CPE和CPEL中，并且当我们研究WEE1 mRNA的平移抑制是否被抑制时，则取消了翻译抑制。这些结果表明，CPE和CPEL序列是与WEE1 mRNA翻译抑制有关的序列。此外，当将3'UTR的WEE1 mRNA注入Xenopus卵母细胞时，它不会被翻译，而是在我们大量注射时翻译。该结果表明，蛋白质成本与WEE1 mRNA的3'UTR结合涉及转化抑制。如果是这样，在注射了大量的3'UTR WEE1 mRNA之后，然后将WEE1 mRNA注入最初被压抑的3'UTR，应该翻译。不出所料，应该翻译应该被翻译抑制的Wee1 mRNA。这些结果表明，卵母细胞中存在一些因素与WEE1 mRNA的3'UTR结合并抑制翻译。