光入力経路の発達に伴う体内時計ネットワークの形成・再構築と機能強化

与光输入通路的发展相关的生物钟网络的形成、重建和功能增强

基本信息

批准号：
17023050
负责人：
池田真行
金额：
$ 1.28万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の第一の目的は、Ca^<2+>感受性蛍光タンパク質で標識された視交叉上核(SCN)スライス培養を網膜神経節細胞(RGCs)と共培養させることにより、RGCs突起とSCNニューロンがシナプス形成する決定的瞬間を顕微鏡下で捕らえ、SCNニューロンの生後発達過程をin vitroで再構築することである。また、この共培養によりSCNニューロンに見られる神経発火やサーカディアンCa^<2+>濃度リズムがどのように影響されるのかを解析することにより、出力リズムが増強されていく過程を可視化しようと試みた。その結果、まずRGCsの分散培養およびスライス培養の作成と、これらに対するCa^<2+>感受性蛍光タンパク質遺伝子(YC2.1およびYC3.6)の導入に成功した。これらは、コラーゲンゲル上での培養と無血清条件下において突起伸張が確認された。また、視交叉上核に投射するメラノプシン陽性RGCsにおいて発現が認められ(論文準備中)、時計調節に係わる可能性が示唆されているコレシストキニンA受容体(CCKAR)の機能解析を行ったところ、CCKAR刺激(CCK8投与)実験において用量依存的な細胞内Ca^<2+>濃度上昇を確認した。CCKA受容体欠損マウスでは体内時計調節における光同調能力が極めて弱いことが報告されており、今後CCKAノックアウトマウスにおいてRGCsのCa^<2+>応答に異常が見られるのかどうか解析する予定である。SCNスライス培養とRGCs共培養実験は突起伸張の方向性と距離が定まらず未だにin vitroにおけるシナプス形成を確認できていない。今後より効率的なモデル実験として不死化したSCNプロジェニター細胞(SCN2.2細胞)の分化誘導実験とRGCsのシナプス形成過程を組み合わせた実験をおこなう予定である。

The primary purpose of this study is to co-culture suprachiasmatic nucleus (SCN) slice cultures labeled with Ca^<2+> sensitive fluorescent proteins with retinal ganglion cells (RGCs), capturing the critical moment when RGCs processes and SCN neurons synapse formation under a microscope, and reconstructing the postnatal developmental process of SCN neurons in vitro.我们还试图通过分析由于这种共文化而在SCN神经元中发现的神经发射和昼夜节律浓度节奏来可视化增强输出节奏的过程。结果，我们首先成功地创建了RGC的分散和切片培养物，并引入了Ca^<2+>敏感的荧光蛋白基因（YC2.1和YC3.6）。这些被证实在胶原蛋白凝胶和无血清条件下培养下有突起。此外，在投射到肌关节核（制备中）中的黑素蛋白阳性RGC中观察到表达，并对胆囊基蛋白A受体（CCKAR）进行了功能分析，这表明它可能与时钟调节有关，证实了剂量调节的剂量依赖于剂量的刺激，在cCCCCCCCCCCCCCCC CCCC CCCCCC中的刺激中的刺激均与CCCCCCCCCCCCCC cccky（CCCK）相关。据报道，CCKA受体缺陷型小鼠的光调能力在内部时钟调节中极为弱，我们现在将分析CCKA敲除小鼠RGC的CA^<2+>反应中的异常。 SCN切片培养和RGCS共培养实验尚未在突出延伸的方向和距离上确定，并且尚未确认体外突触形成。将来，我们计划进行更有效的模型实验，该实验结合了永生的SCN祖细胞（SCN2.2细胞）的分化诱导与RGC的突触形成过程。