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光入力経路の発達に伴う体内時計ネットワークの形成・再構築と機能強化

与光输入通路的发展相关的生物钟网络的形成、重建和功能增强

基本信息

批准号：
17023050
负责人：
池田真行
金额：
$ 1.28万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の第一の目的は、Ca^<2+>感受性蛍光タンパク質で標識された視交叉上核(SCN)スライス培養を網膜神経節細胞(RGCs)と共培養させることにより、RGCs突起とSCNニューロンがシナプス形成する決定的瞬間を顕微鏡下で捕らえ、SCNニューロンの生後発達過程をin vitroで再構築することである。また、この共培養によりSCNニューロンに見られる神経発火やサーカディアンCa^<2+>濃度リズムがどのように影響されるのかを解析することにより、出力リズムが増強されていく過程を可視化しようと試みた。その結果、まずRGCsの分散培養およびスライス培養の作成と、これらに対するCa^<2+>感受性蛍光タンパク質遺伝子(YC2.1およびYC3.6)の導入に成功した。これらは、コラーゲンゲル上での培養と無血清条件下において突起伸張が確認された。また、視交叉上核に投射するメラノプシン陽性RGCsにおいて発現が認められ(論文準備中)、時計調節に係わる可能性が示唆されているコレシストキニンA受容体(CCKAR)の機能解析を行ったところ、CCKAR刺激(CCK8投与)実験において用量依存的な細胞内Ca^<2+>濃度上昇を確認した。CCKA受容体欠損マウスでは体内時計調節における光同調能力が極めて弱いことが報告されており、今後CCKAノックアウトマウスにおいてRGCsのCa^<2+>応答に異常が見られるのかどうか解析する予定である。SCNスライス培養とRGCs共培養実験は突起伸張の方向性と距離が定まらず未だにin vitroにおけるシナプス形成を確認できていない。今後より効率的なモデル実験として不死化したSCNプロジェニター細胞(SCN2.2細胞)の分化誘導実験とRGCsのシナプス形成過程を組み合わせた実験をおこなう予定である。

The first objective of this study was to identify Ca^2+>-sensitive photoreceptors in suprachiasmatic nuclei (SCN) and to culture and co-culture retinal ganglion cells (RGCs). In addition, the concentration of Ca^<2+> in SCN co-culture can be analyzed by visualization of the process. As a result, the preparation of dispersion culture and culture of RGCs and the successful introduction of Ca^<2+>-sensitive fluorescent protein (YC2.1 and YC3.6) were demonstrated. In the absence of serum-based culture, the presence of a protein in the cell was confirmed. The functional analysis of CCKAR and CCKAR stimulation (CCK8 stimulation) confirmed the dose-dependent increase in intracellular Ca^<2+> concentration. CCKA receptor loss is due to internal chronometer regulation. The optical coherence ability is extremely weak. In the future, CCKA receptor loss is due to Ca^<2+> abnormal response of RGCs. SCN culture and RGCs co-culture were conducted to confirm the orientation and distance of protrusion extension in vitro. In the future, the induction of differentiation of SCN cells (SCN2.2 cells) and the formation of RGCs will be combined to determine the future development of SCN cells.