人工核酸による脳局所急性ノックダウン手法の開発とこれを用いた睡眠制御分子の探索

利用人工核酸开发急性脑局部敲除方法并利用该方法寻找睡眠调节分子

基本信息

批准号：
21659056
负责人：
池田真行
金额：
$ 1.92万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21659056/
关键词：
睡眠・覚醒遺伝子改変ラット

项目摘要

睡眠の制御機構は脳内の特定の神経回路に大きく依存することが分かってきている。本研究では架橋構造を核酸分子内に持つ人工核酸(Locked Nucleic Acid:LNA)を用いて、脳局所のグルタミン酸受容体をノックダウンし、これに伴う行動学的な変化を解析することを試みた。初年度に、培養細胞を用いたモデル実験で、代謝型グルタミン酸1α型受容体(mGluR1α)をノックダウンするための、蛍光タグLNAの有効性を確認したので、本年度は、ラットにおいて、両側の外側膝状体背側にLNAをマイクロインジェクションし、睡眠脳波記録を行った。蛍光タグが正しく外側膝状体背側部に注入された脳サンプルにおいて、ウエスタンブロッティング解析した結果、外側膝状体のmGluR1αタンパク質発現に3割程度の減少が認められた。しかしながら、行動学的には、PLC-β4欠損マウス(mGluR1αの細胞内シグナリング機構が欠損しているマウス)と相似した、レム睡眠異常は観察されなかった。これらのことは、残存して機能しているmGluR1αタンパク質で、十分に睡眠覚醒サイクルを正常に維持できることを示している。より大きなノックダウン効果を得るためには、LNAのデザインの再考を含め、今後さらなる研究が必要であるものと思われる。本年度は、さらに、蛍光タグしたヒスタミンH1受容体アンタゴニストによる睡眠解析の促進効果も検討を行い、その結果、第3脳室への連続微小注入により、ノンレムの増加とレム睡眠の抑制効果を観察した。この場合、蛍光標識は、脳室周囲にのみ観察されたため、抗ヒスタミン剤による睡眠調節には、内側視索前野など、脳の限られた領域での作用が、睡眠調節に十分であることが示唆された。

已经发现睡眠控制机制在很大程度上取决于大脑中的特定神经回路。在这项研究中，我们试图使用锁定的核酸（LNA），该核酸（LNA）在核酸分子中具有交联结构来击倒大脑本地的谷氨酸受体并分析相关的行为变化。在第一年，在使用培养细胞的模型实验中，确认荧光标记的LNA的有效性被证实可以击倒代谢性谷氨酸1α受体（MGLUR1α），因此，今年在大鼠中，LNA被微型注射到横向遗传体和睡眠EEG的背侧。蛋白质印迹分析表明，通过横向遗传体中MGLUR1α蛋白的表达降低了30％，发现MGLUR1α蛋白在侧向遗传体中的表达。但是，从行为上讲，没有观察到与PLC-β4缺陷型小鼠相似的REM睡眠异常（MGLUR1α的细胞内信号传导机制多重缺陷）。这些表明其余功能性MGLUR1α蛋白可以正常维护睡眠循环。将来可能需要进一步的研究，包括重新考虑LNA的设计，以实现更大的敲低效果。今年，我们还研究了荧光标记的组胺H1受体拮抗剂对促进睡眠分析的影响，结果，我们观察到通过连续微分注射到第三个心室中，REM睡眠的非REM和REM睡眠效果的增加。在这种情况下，仅在心室周围观察到荧光标记，这表明在有限大脑的有限区域中，抗组胺药的睡眠调节（例如内侧前皮层）足以适应睡眠调节。