26SプロテアソームのX線結晶構造解析による巨大蛋白質複合体の分解機構解析

利用 26S 蛋白酶体的 X 射线晶体结构分析分析大蛋白质复合物的降解机制

• 批准号: 17053010
• 负责人: 水島 恒裕
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17053010/
• 关键词: プロテアソーム; 超分子複合体; X線結晶構造解析; 蛋白質分解

26Sプロテアソームは分子量2.5MDaの巨大なプロテアーゼであり、750kDa、28サブユニットからなるタンパク質分解酵素20Sプロテアソームを中心に、分子量700kDa、16種類以上のサブユニットからなる制御因子複合体PA700が20Sプロテアソームの両端に2分子会合し超分子複合体を形成している。26Sプロテアソームはユビキチンの付加された細胞周期制御タンパク質や変性タンパク質を認識し特異的に分解する役割を担っており、巨大な複合体を形成することで特定タンパク質だけを、ATPを利用し高次構造をほどきながら効率よく分解する。本研究では26SプロテアソームのX線結晶構造解析による立体構造の解明とその機能の解析を目指し、遺伝子組み換えを行った酵母を用いて26Sプロテアソームの発現、精製、結晶化を行った。26Sプロテアソームは多数のサブユニットからなる超分子複合体であるため、カラムクロマトグラフィーを繰り返し行う通常のタンパク質精製方法では複合体からサブユニットが解離してしまうため、結晶化に不可欠な均一な精製タンパク質を得ることは困難である。そこで、プロテアソーム制御因子複合体PA700のサブユニットにFLAGタグを付加した遺伝子組み換え酵母を使用することで迅速な精製を可能にし、また立体構造解析において高熱菌タンパク質を用いた研究が通常の酵素より安定性が高いことから頻繁に行われていることを考え、耐熱性酵母を用いた26Sプロテアソームの発現システムを使用した。この発現系により培養した酵母からFLAGタグによるアフィニティーカラムと陰イオン交換クロマトグラフィーにより高純度にタンパク質を精製し、このサンプルを用い現在、結晶化のスクリーニングを行い、結晶化条件を探索している。

26 s プ ロ テ ア ソ ー ム は molecular weight 2.5 MDa の huge な プ ロ テ ア ー ゼ で あ り, 750 kda, 28 サ ブ ユ ニ ッ ト か ら な る タ ン パ ク nature decompose ferment 20 s プ ロ テ ア ソ ー ム を center に, molecular weight of more than 700 kda, 16 species の サ ブ ユ ニ ッ ト か ら な る suppression factor complex PA700 が 20 s The プロテアソ プロテアソ ム ム に at the two ends of the に molecules meet up to form a <s:1> supramolecular complex を to form an <s:1> て る る る. 26 s プ ロ テ ア ソ ー ム は ユ ビ キ チ ン の plus さ れ た cell cycle suppression タ ン パ ク qualitative や - sex タ ン パ ク qualitative を know し specific に decomposition す る "を cut bear っ て お り, huge な complex を form す る こ と で specific タ ン パ ク qualitative だ け を, ATP を し high secondary tectonic を ほ ど き な が ら sharper rate よ く decomposition す る. This study で は 26 s プ ロ テ ア ソ ー ム の X-ray crystal structure parsing に よ る three-dimensional structure の interpret と そ の function analytical を の refers し, heritage 伝 subgroups み in え を line っ た yeast を with い て 26 s プ ロ テ ア ソ ー ム の 発 now, refined, crystallization を line っ た. 26 s プ ロ テ ア ソ ー ム は most の サ ブ ユ ニ ッ ト か ら な る supramolecular complexes で あ る た め, カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を Qiao り return line し う usually の タ ン パ ク quality refined methods で は complex か ら サ ブ ユ ニ ッ ト が dissociation し て し ま う た め, crystallization に not owe な uniform な refined タ ン パ ク qualitative を must る こ と は difficult で あ る . そ こ で, プ ロ テ ア ソ ー ム suppression factor complex PA700 の サ ブ ユ ニ ッ ト に FLAG タ グ を plus し た heritage 伝 subgroups み in え yeast を use す る こ と rapid で な refined を may に し, ま た three-dimensional structure parsing に お い て high bacteria タ ン パ ク qualitative を with い た study が usually の enzyme よ り high stability が い こ と か ら frequent line に わ れ て い る こ と を え test, heat resistant yeast を い た 26 s プ ロ テ ア ソ ー ム の 発 now シ ス テ ム を use し た. こ の 発 now is に よ り cultivate し た yeast か ら FLAG タ グ に よ る ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム と Yin イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り high-purity に タ ン パ ク を refined し, こ の サ ン プ ル を い now, crystallization の ス ク リ ー ニ ン グ を い, crystallization conditions を し て い る.

项目成果

The crystal structure of human Atg4b, a processing and de-conjugating enzyme for autophagosome-forming modifiers

• DOI: 10.1016/j.jmb.2005.11.018
• 发表时间: 2006-01-27
• 期刊: JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 5.6
• 作者: Kumanomidou, T;Mizushima, T;Yamane, T
• 通讯作者: Yamane, T

糖鎖認識ユビキチンリガーゼの立体構造から明らかになった蛋白質分解のための糖鎖の役割

从糖链识别泛素连接酶的三维结构揭示糖链在蛋白质降解中的作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: 日本結晶学会誌 47
• 作者: Kumanomidou T;Mizushima T;Komatsu M;Suzuki A;Tanida I;Sou YS;Ueno T;Kominami E;Tanaka K;Yamane T;水島恒裕
• 通讯作者: 水島恒裕