電子線トモグラフィーと単粒子解析法による生体超高分子の構造解析

本研究の計画通り、まず、シミュレーションによる三次元再構成像の分類を評価した。得られた情報から、k-means法等の一般的な分類方法だけでは、どの程度まで細かく分類してよいかの指標を作製するのが難しく、新たに三次元画像分類用のアルゴリズムの開発が必要なことが判明した。次に実際の試料を用いた実験として2種類のインテグリンの電子線トモグラフィーを行った。RGD結合型インテグリンとしてその生化学的性質がよく研究されているインテグリンαIIbβ3を、コラーゲン結合型として、I-domainを含むα2β1を試料として撰んだ。それぞれ、不活性な状態を再現できるCLASPをサブユニット間に挿入したもの、CLASP間を切断し、活性型のコンフォメーションをとりやすくしたものを用意し、まず、2次元での単粒子解析を行った。予想通り、折れ曲がり構造と延長構造とが明瞭に観察された。現在、これらの電子線トモグラフィーのデータを大阪大学超高圧電子顕微鏡センターの透過型電子顕微鏡H9500SDと自動電子線トモグラフィーソフトEMMENU3を使用して取得、解析中である。また、二軸傾斜による撮影を細胞外タンパク質Reelinの変異型を用いて、行い、わずか10個の粒子から、信頼性の高い三次元再構成像を本方法で得られることを示した(投稿中)。インテグリンやReelinの電子線トモグラフィー解析を行う際に問題となったのは、これらタンパク質のトモグラフィー解析をする専門のプログラムがないことである。画像解析上の多くの問題点の克服を含め、専用ソフトウエアの開発を九州工業大学安永助教授との共同研究で進めている。現在は、通常61枚〜121枚にもなる傾斜像シリーズのなかのわずか一枚の画像でタンパク質粒子の座標を与えてやれば、全て自動でそれぞれの粒子の三次元再構成像が得られるところまで成果をあげている(投稿準備中)。

本研究の計画通り、まず、シミュレーションによる三次元再構成像の分類を評価した。得られた情報から、k-means法等の一般的な分類方法だけでは、どの程度まで細かく分類してよいかの指標を作製するのが難しく、新たに三次元画像分類用のアルゴリズムの開発が必要なことが判明した。次に実際の試料を用いた実験として2種類のインテグリンの電子線トモグラフィーを行った。RGD結合型インテグリンとしてその生化学的性質がよく研究されているインテグリンαIIbβ3を、コラーゲン結合型として、I-domainを含むα2β1を試料として撰んだ。それぞれ、不活性な状態を再現できるCLASPをサブユニット間に挿入したもの、CLASP間を切断し、活性型のコンフォメーションをとりやすくしたものを用意し、まず、2次元での単粒子解析を行った。予想通り、折れ曲がり構造と延長構造とが明瞭に観察された。現在、これらの電子線トモグラフィーのデータを大阪大学超高圧電子顕微鏡センターの透過型電子顕微鏡H9500SDと自動電子線トモグラフィーソフトEMMENU3を使用して取得、解析中である。また、二軸傾斜による撮影を細胞外タンパク質Reelinの変異型を用いて、行い、わずか10個の粒子から、信頼性の高い三次元再構成像を本方法で得られることを示した(投稿中)。インテグリンやReelinの電子線トモグラフィー解析を行う際に問題となったのは、これらタンパク質のトモグラフィー解析をする専門のプログラムがないことである。画像解析上の多くの問題点の克服を含め、専用ソフトウエアの開発を九州工業大学安永助教授との共同研究で進めている。現在は、通常61枚〜121枚にもなる傾斜像シリーズのなかのわずか一枚の画像でタンパク質粒子の座標を与えてやれば、全て自動でそれぞれの粒子の三次元再構成像が得られるところまで成果をあげている(投稿準備中)。