膜貫通型膜タンパク質の反応機構解明のための赤外分光法の開発

开发红外光谱阐明跨膜蛋白的反应机制

• 批准号: 17053023
• 负责人: 小倉 尚志
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17053023/
• 关键词: 膜タンパク質; 赤外分光法; 反応機構; 呼吸鎖; 共鳴ラマン; ミトコンドリア; 時間分解; 振動スペクトル

1.新規赤外分光光度計の開発 酵素タンパク質の反応機構を明らかにするためには、活性部位に異方性をもって配置されたアミノ酸の反応性の違いを検出し得るほど高感度の時間分解赤外分光法が必要不可欠である。しかし、どのようなタンパク質にも適用可能な時間分解赤外分光法は開発されていなかった。この目的のために本研究では、赤外マルチチャンネル検出器と流路が200μm×200μmのCaF_2製フローセルを組み合わせ、赤外白色レーザー光を光源とする新規赤外分光光度計を設計した。まず、グローバー光源を用いて、一酸化炭素結合型チトクロムc酸化酵素を測定したところ、νc-o由来の吸収帯の検出に成功した。次に一酸化炭素結合型酵素の光乖離と再結合のダイナミクスの追跡に挑戦し、Δt=0、20、40msの時間分解赤外吸収スペクトルの測定に成功した。したがって、フローセルを用いて酵素の構造ダイナミクスを測定できる新規装置が稼働した。より高精度のスペクトルを得るための光源である赤外白色レーザーは、現在、最終調整を行っており、一ヶ月以内に終わる予定である。2.ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素による酸素活性化反応の追跡 ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素の時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素化型、P型およびF型反応中間体に由来するν<Fe>-o振動モードの観測に成功した。これらの振動数は、可溶化酵素の、対応する反応中間体の振動数と一致した。一方、酸素化型反応中間体は、ミトコンドリア中では反応開始後1.4msでも観測されたが、可溶化状態では0.5ms程度で消失することが知られていた。このことは、ミトコンドリア内膜系がチトクロムc酸化酵素の反応中間体の寿命に影響を与えていることを意味するが、そのしくみを調べることが次の課題である。

1. The new method of infrared spectrophotometry for the development of enzymes in the presence of a reactive mechanism is necessary for the detection of highly sensitive time-resolved infrared spectrophotometry. It is possible to apply the time decomposition infrared spectroscopy to the development of the material. In this study, a new method of red spectrophotometry was designed for the detection of CaF_2 in a flow path of 200 μm×200μm The detection of the enzyme in the presence of a carbon-binding enzyme in the presence of a light source was successful. The second is the determination of photodissociation and recombination of acidified carbon-binding enzyme with time t=0, 20 and 40ms A new method for determining the structure of enzymes is proposed. High precision, high precision, high 2. Determination of the time-dependent resonance of the enzyme in the enzyme system. The determination of the origin of V-O vibration of acid-type, P-type and F-type reaction intermediates <Fe>was successful. The number of vibrations of the enzyme, solubilizing enzyme and reaction intermediate is consistent. A simple, acid-type reaction intermediate was detected 1.4 ms after the start of the reaction, and the solubilized state disappeared 0.5 ms after the reaction. This paper discusses the influence of different membrane systems on the life span of enzyme intermediates.

项目成果

ミトコンドリア中のシトクロム酸化酵素の in situ ラマン散乱

线粒体细胞色素氧化酶的原位拉曼散射

• DOI: 10.2142/biophys.45.272
• 发表时间: 2005
• 作者: 尚志 小倉;俊成 高橋;繁樹 黒岩
• 通讯作者: 繁樹 黒岩

Probing the oxygen activation reaction in intact whole mitochondria through analysis of molecular vibrations.

• DOI: 10.1021/ja051761a
• 发表时间: 2005-07
• 期刊: Journal of the American Chemical Society
• 影响因子: 15
• 作者: Toshinari Takahashi;S. Kuroiwa;T. Ogura;S. Yoshikawa