紫外共鳴ラマン分光法によるプロトンATP合成酵素の動的構造変化の遺跡

紫外共振拉曼光谱研究质子ATP合酶动态结构变化

• 批准号: 11116206
• 负责人: 小倉 尚志
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11116206/
• 关键词: 生体エネルギー変換; チトクロム酸化酵素; 紫外共鳴ラマン; プロトンポンプ; タンパク質; ダイナミクス; 酸素活性化

タンパク質を紫外光(200-250nm)で励起すると、おもに芳香族アミノ酸側鎖の振動スペクトルが選択的に浮き彫りになる。同時に蛍光が可視領域に現れることがあり、通常の1次元検出器は紫外から可視域に渡って感度を持つので、可視の蛍光がラマンスペクトルに妨害を与えることがある。そこで、200-300nmのみに感度を持つ光電面を採用した画像増幅器にCCD検出器を取り付けた新しい紫外専用1次元検出器を製作し、これとシングル分光器を組み合わせて紫外共鳴ラマン分光光度計を組み立てた。励起波長は244nmとし、レーリー光による迷光を軽減するため溶液フィルターを用いた。試運転としてこの装置をローダミン6Gに適用したところ、充分質の高い紫外共鳴ラマンスペクトルが得られ、可視の強い蛍光の妨害を受けないことが確かめられた。次にチトクロム酸化酵素に応用したところ、良好な紫外共鳴ラマンスペクトルが得られた。おもにトリプトファンやチロシン残基の振動モードが観測された。そのほかにリン脂質のC=C二重結合に由来するラマン線が観測され、酸化型と還元型で強度が異なることから、酸化還元に伴うリン脂質結合部位の構造変化が示された。チトクロム酸化酵素は溶液中で二量体(分子量420kD)またはそれ以上で存在していると考えられており、このような大きな複合体の紫外共鳴ラマンスペクトルが初めて観測されたので、ATP合成酵素の測定も可能になった。

用紫外线（200-250 nm）的蛋白质激发选择性地突出了芳香氨基酸侧链的振动光谱。同时，荧光可能出现在可见区域，并且像往常一样，一维探测器从紫外线到可见区域敏感，可见荧光会干扰拉曼光谱。因此，使用图像放大器制造了一种新的一维紫外线检测器，该图像放大器采用光电表面仅对200-300 nm敏感，并将CCD检测器连接到单个光谱仪上以组装紫外线共振拉曼分光光度计。激发波长为244 nm，并使用溶液过滤器来减少雷利光引起的流浪光。当该设备作为测试运行应用于Rhodamine 6G时，已确认它不会干扰强大的可见荧光。接下来，当应用于细胞色素氧化酶时，获得了良好的紫外线拉曼光谱。主要观察到色氨酸和酪氨酸残基的振动模式。此外，观察到源自磷脂的C = C双键的拉曼线，氧化和还原形式的强度有所不同，表明由于氧化和氧化还原而引起的磷脂结合位点的结构变化。人们认为细胞色素氧化酶存在于二聚体（分子量：420 kd）或更高的溶液中，并且首次观察到如此大复合物的紫外线共振拉曼谱，从而可以测量ATP合成酶。

项目成果

T. Tomita: "Resonance Raman Investigation of Fe-N-O Structure of Nitrosylheme in Myglobin and Its Mutants"Biochemistry. 103. 7044-7054 (1999)

T. Tomita：“肌球蛋白及其突变体中亚硝基血红素 Fe-N-O 结构的共振拉曼研究”生物化学。

小倉尚志: "シトクロムc酸化酵素による酵素分子還元反応の化学:共鳴ラマン分光法による研究"生化学. 72(印刷中). (2000)

Takashi Ogura：“细胞色素 c 氧化酶的酶促分子还原反应的化学：通过共振拉曼光谱进行研究”《生物化学》72（出版中）。