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ナノ開口基板を用いたシャペロニンGroELの1分子機能解析

使用纳米孔径基底对伴侣蛋白 GroEL 进行单分子功能分析

基本信息

批准号：
18031008
负责人：
上野太郎
金额：
$ 3.39万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18031008/
关键词：
シャペロニンナノ開口基板 1分子蛍光イメージング協同性

项目摘要

本研究では、シャペロニンGroELの両側に2個のGroESが同時に結合したFootball型複合体(FB)の有無を明らかにし、1分子解析を通じてそのタイミングを明らかにしようとしている。今年度、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を指標にすることで、蛍光分光器を用いてGroELとGroESの結合率の測定に成功し、1)FBは、反応サイクルの約40%で形成されている2)GroELへ2個目のGroESが結合できるのは、GroESが約300nM以上になったときである2)FBの形成率は、ADPにより著しく阻害される3)ATP加水分解が非常に遅い変異GroEL(D398A)はFBを形成することを明らかにし、従来の反応サイクルのモデルを大きく訂正する必要性を示した(Sameshima et.al.,投稿中)。さらにFBの形成過程を詳細に理解するため、昨年度開発したナノ開口基板を用いて、500nM蛍光標識GroESと4.5uM無標識GroES存在下でGroELとの結合解離反応を1分子解析した。蛍光分光器の実験結果から、大腸菌内の発現濃度と同じ約5μMのGroES存在下ではFBが形成されることが分かっている。事前の予想とは異なり、GroELとGroESの結合時間は、FBが形成されない20nM GroES存在下での1分子解析の結果と同じであった。そこで、FBが形成される様子を直接可視化するため、500nM Cy3-GroESと500nM Cy5-GroES存在下で、ナノ開口基板上に固定されたGroELへの相互作用を観察した。ほとんどの場合、両側のリングにGroESが交互に結合解離を繰り返していたが、同時にCy3-GroESとCy5-GroESが結合している状態も観察された。現在、その詳細を解析している。

In this study, we compared the results of GroEL analysis with 2 GroES and Football complex (FB). The results of this study showed that there was no significant difference between the two groups of Football complex (FB). This year, the total optical transmission (FRET) is used to determine the success rate of the optical spectrometer and the optical spectrometer using the combination rate of GroEL and GroES. 1) FB, about 40% of the total, 2) GroEL, 2) the combination of GroES, GroES and more than 300nM. 2) FB formation rate. ADP is very sensitive to the formation of GroEL (D398A) FB by adding water to make sure that it is necessary to show the necessity (Sameshima et.al). In the contribution). During the process of FB formation, you can understand how to use the substrate for the opening of the device yesterday, and that the 500nM light tag recognizes the existence of the GroES 4.5uM tag GroES in combination with the dissociation of anti-interference 1 molecular analysis. In the presence of about 5 μ M GroES, the results of the optical spectrometer test results showed that the FB was formed in the presence of the same as that of about 5 μ M in the presence of the spectrometer. It is expected that the results of molecular analysis of IL-1 in the presence of 20nM GroES are the same as those in the presence of GroEL, GroEL, and FB. The formation of the device and the FB can directly modify the performance of the device, the presence of the 500nM Cy3-GroES 500nM Cy5-GroES and the fixing of the GroEL interaction on the opening substrate. Please check the status of the data in the same time as you use the Cy3-GroES Cy5-GroES to check the status of the data. At present, we need to analyze the situation.