ナノ開口基板を用いたシャペロニンGroELの1分子機能解析

本研究では、シャペロニンGroELの両側に2個のGroESが同時に結合したFootball型複合体(FB)の有無を明らかにし、1分子解析を通じてそのタイミングを明らかにしようとしている。今年度、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を指標にすることで、蛍光分光器を用いてGroELとGroESの結合率の測定に成功し、1)FBは、反応サイクルの約40%で形成されている2)GroELへ2個目のGroESが結合できるのは、GroESが約300nM以上になったときである2)FBの形成率は、ADPにより著しく阻害される3)ATP加水分解が非常に遅い変異GroEL(D398A)はFBを形成する ことを明らかにし、従来の反応サイクルのモデルを大きく訂正する必要性を示した(Sameshima et.al.,投稿中)。さらにFBの形成過程を詳細に理解するため、昨年度開発したナノ開口基板を用いて、500nM蛍光標識GroESと4.5uM無標識GroES存在下でGroELとの結合解離反応を1分子解析した。蛍光分光器の実験結果から、大腸菌内の発現濃度と同じ約5μMのGroES存在下ではFBが形成されることが分かっている。事前の予想とは異なり、GroELとGroESの結合時間は、FBが形成されない20nM GroES存在下での1分子解析の結果と同じであった。そこで、FBが形成される様子を直接可視化するため、500nM Cy3-GroESと500nM Cy5-GroES存在下で、ナノ開口基板上に固定されたGroELへの相互作用を観察した。ほとんどの場合、両側のリングにGroESが交互に結合解離を繰り返していたが、同時にCy3-GroESとCy5-GroESが結合している状態も観察された。現在、その詳細を解析している。

本研究では、シャペロニンGroELの両側に2個のGroESが同時に結合したFootball型複合体(FB)の有無を明らかにし、1分子解析を通じてそのタイミングを明らかにしようとしている。今年度、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を指標にすることで、蛍光分光器を用いてGroELとGroESの結合率の測定に成功し、1)FBは、反応サイクルの約40%で形成されている2)GroELへ2個目のGroESが結合できるのは、GroESが約300nM以上になったときである2)FBの形成率は、ADPにより著しく阻害される3)ATP加水分解が非常に遅い変異GroEL(D398A)はFBを形成する ことを明らかにし、従来の反応サイクルのモデルを大きく訂正する必要性を示した(Sameshima et.al.,投稿中)。さらにFBの形成過程を詳細に理解するため、昨年度開発したナノ開口基板を用いて、500nM蛍光標識GroESと4.5uM無標識GroES存在下でGroELとの結合解離反応を1分子解析した。蛍光分光器の実験結果から、大腸菌内の発現濃度と同じ約5μMのGroES存在下ではFBが形成されることが分かっている。事前の予想とは異なり、GroELとGroESの結合時間は、FBが形成されない20nM GroES存在下での1分子解析の結果と同じであった。そこで、FBが形成される様子を直接可視化するため、500nM Cy3-GroESと500nM Cy5-GroES存在下で、ナノ開口基板上に固定されたGroELへの相互作用を観察した。ほとんどの場合、両側のリングにGroESが交互に結合解離を繰り返していたが、同時にCy3-GroESとCy5-GroESが結合している状態も観察された。現在、その詳細を解析している。