ナノ開口基板を用いたGroEL-GroESの結合解離の1分子蛍光イメージング

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次世代1分子蛍光イメージング技術として注目されるナノ開口基板を用いた測定法は、全反射照明法を用いた従来の1分子蛍光イメージング法では不可能なμMオーダーの蛍光色素存在下での1分子解析を可能にする。本研究では、この技術を応用してシャペロニンGroELの1分子機能解析を行うことを目的としている。実験を行う過程で、タンパク質から発せられる蛍光がアルミニウムのナノ開口を通過する際に減衰してしまうという問題が明らかになった。そこで、ナノ開口の底部の石英ガラスを数十nm掘り下げ、タンパク質をナノ開口の外部に固定することで蛍光強度の減衰を抑えた。その結果、SNを約2倍向上することに成功した(Miyake, et. al.,投稿中)。300nM以上のGroES存在下では、シャペロニンGroELの両方のリングに2個のGroESが結合したFootball型複合体(FB)が形成されることが分かっている。そこで、この掘り下げ型ナノ開口基板を利用して、500nM蛍光標識GroESと4.5uM無標識GroES存在下でGroELとの結合解離反応を1分子解析した。事前の予想とは異なり、GroELとGroESの結合時間は、FBが形成されない20nMGroES存在下での1分子解析の結果と同じであった。そこで、FBが形成される様子を直接可視化するため、500nM Cy3-GroESと500nM Cy5-GroES存在下で、ナノ開口基板上に固定されたGroELへの相互作用を観察した。ほとんどの場合、両側のリングにGroESが交互に結合解離を繰り返していたが、Cy3-GroESとCy5-GroESが同時に結合している状態も観察されることが明らかになった。