シャペロニンによるタンパク質折れたたみ機構の一分子蛍光イメージング

伴侣蛋白的蛋白质折叠机制的单分子荧光成像

• 批准号: 01J08720
• 负责人: 上野 太郎
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J08720/
• 关键词: シャペロニン; GroEL; タンパク質の折れたたみ; 1分子蛍光イメージング

シャペロニンGroELは、ATP加水分解を伴いながらGroESと結合解離を繰り返し、タンパク質の折れたたみを助ける。これまでに我々は1分子蛍光イメージング法を用いて、この反応サイクルが時定数3秒、5秒の2つの律速過程から構成されていることを明らかにした。また、GroELに結合した酸変性GFPの折れたたみは、GroESが結合した後の3秒間抑制されており、ATP加水分解後に進行するという新しいモデルを提案した。このモデルを検証するためには、GroEL-GroES複合体内部での基質タンパク質の動きを直接観察する必要がある。そこで、蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)を利用してGroELのApical Domain(315番目のアミノ酸残基)と基質タンパク質の距離の変化を観察した。まず、蛍光色素IC5(acceptor)をGroEL変異体(E315C)に、蛍光色素Cy3(donor)を基質タンパク質(緑色蛍光タンパク質:GFP)に結合させた。酸変性させたGFP-donorをGroEL-acceptorに結合させたところ、FRETによりドナー蛍光強度が減少した(61%のFRET効率)。さらに過剰量のGroES存在下でATPと混合すると、0.5秒でFRET効率が46%に下がり、3秒で再び65%まで上昇した後、続く3.3秒でほぼFRETが解消された。GFPがGroES結合後3秒間折れたたみが阻害されていることを考慮すると次のような結論を得られる。すなわち、GroEL-GFP複合体にGroESが結合することでGFPが0.5秒で内部空洞下方に落とし込まれ、3秒後に空洞内に浮き上がった後、3〜4秒でGroESが解離して外部に放出される。この結果は、GroEL依存的に折れたたむMalate Dehydrogenaseを基質タンパク質に用いたときも同様に得られ、基質タンパク質の種類によらず、3秒間の折れたたみ阻害が起こると推察された。以上は、従来の反応モデルを大きく修正するものであり、本モデルにより基質タンパク質がGroEL内部に高効率で取り込まれる理由が初めて説明された。

For example, when the ATP is dissolved in water, it can be dissolved in water. This is the first time that a molecule has been used in the process of light emission, and the second time that a molecule has been used in the process of light emission is 3 seconds, 5 seconds, and 2 seconds. GroEL binds to the acidic GFP, and GroES binds to the acidic GFP within 3 seconds of inhibition. ATP hydrolyzes to form a new protein. It is necessary to observe directly the motion of matrix in GroEL-GroES complex. In addition, the optical resonance shift method (FRET) was used to investigate the change of Apical Domain(315 amino acid residues) and matrix quality. The pigment IC5 (acceptor) is incorporated into the matrix (green pigment:GFP) by the pigment Cy3(donor). The GFP-donor GroEL-acceptor decreases the intensity of light (61% FRET efficiency). In the presence of excessive amounts of GroES, ATP is mixed, FRET efficiency decreases by 46% in 0.5 seconds, increases by 65% in 3 seconds, and FRET is eliminated in 3.3 seconds. 3 seconds after GFP GroES binding, it is considered that the damage is caused by the binding of GFP GroES. GroEL-GFP complex GroES binds to GFP within 0.5 seconds, falls below the inner cavity, floats within the cavity within 3 seconds, and dissociates from GroES within 3 to 4 seconds. The result is that the matrix is the same as the matrix. The reasons for the above are as follows:

项目成果

上野太郎, 田口英樹: "GFP折れたたみからGroELの機能を探る"実験医学. 22(1). 90-91 (2004)

Taro Ueno、Hideki Taguchi：“探索折叠 GFP 的 GroEL 功能”实验医学 22(1)。