生細胞多重蛍光標識を用いたタンパク合成定量法の開発と応用

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神経細胞において活動依存的な局所タンパク翻訳は神経細胞の恒常性・可塑性に重要な役割を果たしていると考えられる。平成18年度においては局所タンパク翻訳を可視化し、定量的に解析する方法を確立することを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1.タンパク合成レポーター系の構築樹状突起における局所タンパク翻訳が示唆されているシナプス関連タンパク質に酵素タグを付加したレポーターを作製し、部位特異的タンパク蛍光標識を用いた蛋白検出システムの構築をした。この系を用いて蛍光多重パルスチェイス染色を行うことにより、既存および新規に合成されたタンパクを検出することが可能となつた。2.神経細胞における活動依存的、局所タンパク合成の可視化・定量1で作製したレポータープラスミドを分散培養神経細胞に導入し、樹状突起において神経活動依存的なタンパク合成を可視化し、定量解析した。また、細胞体から切り離された単離樹状突起を標本に用いて、新規に合成されたタンパクの検出を試みた。蛍光基質の最適化やシグナル増幅の検討を行い、単離樹状突起における局所タンパク合成の可視化に成功した。3.レポーターの改良レポーターに以下の使用目的に応じた改変を加えた。(1)神経細胞への導入を効率化するためレポーターコンストラクトのウイルスベクターへの導入。(2)レポーターの発現量および時期を制御するため、薬剤発現制御システムへ導入。