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ゲノムDNA単分子解析と細胞サイズベシクル中での生化学実験

细胞大小囊泡中的基因组 DNA 单分子分析和生化实验

基本信息

批准号：
18048007
负责人：
小穴英廣
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18048007/
关键词：
ゲノムDNA オプティカルマッピング光ピンセット PNA 三重鎖(triplex)

项目摘要

本研究では、一つの細胞からDNAを切断することなく取り出し、顕微鏡下でオプテイカルマッピングを行い、探索したい塩基配列の有無、存在する場合はどの位置にあるかを迅速に明らかにするという解析手法の確立を目指している。具体的には超好熱始原菌をもちいて本手法の有用性を示すと共に超好熱始原菌研究に有用な情報を提供する事を目指している。本年度は、超好熱始原菌KOD1株のゲノムDNA(全長約680um)に対し、断片化させることなく単分子オプティカルマッピングを行うことを目指し、研究を進めた。KOD1ゲノムDNAを浸透圧ショックによる細胞破壊で取り出した後、蛍光標識オリゴPNAプローブを導入して複製開始領域の特定塩基配列部とPNAとで三重鎖を形成させ、ゲノムDNA分子を光ピンセットで伸展させてオプティカルマッピングを行った。オリゴPNAプローブは、KOD1ゲノムDNAの複製開始領域を認識するようにデザインし、蛍光標識にはQdot用いた。前年度、一部伸展されたDNAの鎖上にQdotの輝点を確認する事に成功していたが、蛍光プローブの非特異吸着の問題が認められていた。本年度は実験プロトコルを改良し、非特異吸着を押さえつつ、十分な量の解析サンプルを得ることに成功した。

In this study, the DNA of a cell was cut off, extracted, and analyzed under microscopes to explore the presence or absence of DNA in the cell array. Specific information on the usefulness of this method is provided for the study of super-thermogenic bacteria. This year, we have made progress in the research and development of the DNA of strain KOD1 (about 680um in length). KOD1: DNA penetration, DNA extension, DNA labeling, DNA triple-lock formation, DNA molecule insertion, DNA triple-lock insertion, DNA triple-lock insertion, DNA tri PNA, KOD1, DNA replication initiation domain, Qdot, In the past year, a part of the DNA chain was successfully identified by Qdot and non-specific adsorption problems. This year, we have achieved success in improving the quality of our products, ensuring non-specific adsorption, and obtaining a very large amount of analytical support.