大腸菌ミニFDNA複製制御機構:イテロンによるDNA複製阻害機構の解析

大肠杆菌mini-FDNA复制控制机制：iteron分析DNA复制抑制机制

• 批准号: 09266209
• 负责人: 和田 千恵子
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09266209/
• 关键词: ミニFプラスミド; 繰り返し配列(イテロン); Incompatibility; コピー数; Hand-cuffing; incC

大腸菌を主な宿主として複製するミニFは染色体あたり1〜2コピーで安定に維持され、又、細胞周期の特定の時期に複製することも知られている。この厳密な調節を担うものは複製開始蛋白質(RepE)とincC領域、さらに未知の負の調節因子等である。ミニFのrepE遺伝子の下流にあるincC領域はori2内のイテロンとほぼ同じ塩基配列を持つイテロンが5個存在する。この領域のイテロン内の変異及び欠失によりミニFのコピー数が増加することは古くから知られていたが私達も確認した。又この領域を持つマルチコピープラスミドとミニFは共存出来ない(Incompatibilityを示す)。IncC領域はミニF ori2に対してcis位置、trans位置にある場合にかかわらず、ミニFのDNA複製、多分、DNA複製開始を阻害する。つまりこの領域はDNA複製の負の制御に重要な役割を担っている。これらの阻害機構の詳細は現在明らかにされていない。私達はこれらの機構を明らかにするためにincC領域にPCR法によって変異を導入し、Incompatibilityを示さなくなった変異IncCを多数分離し、それらの変異位置を決定した(研究計画の1)。変異イテロン及び変異IncC領域のゲルシフトアセイによりRepEが結合出来るかどうかを調べた(研究計画の2)。in vivoでの細胞内RepE濃度の増加によるミニFのコピー数変動を調べた(研究計画の4)。研究計画になかったが野性型ミ二FのIncC領域を変異IncC領域と簡単に置き換えられるミニFの構築を行い、それらのコピー数を測定した。これらの結果からIncCによるミニF複製阻害にはRepE-イテロン複合体の形成が必要であるが充分でなく、ori2-RepE,incC-RepE間の相互作用が重要である事が推定された。つまり、ミニFのコピー数調節機構はTitration Modelでは説明できないことがわかった。現在、P1,PK2,R6Kの複製調節機構に関してHand Cuffing Modelが提唱されているが、Fの場合に適応できるかどうか、また新しいモデルの可能性も含めて、解析を進めている。これと関連して電子顕微鏡を用いて直接IncC領域イテロン-RepEとRepE一ori2イテロンとの結合を観察する試みから予備的な結果であるが、ループ構造が見られた(上智大 廣川先生との共同研究)。Fの系での成果はF類似プラスミドだけでなく、類似構造の枯草菌等の細菌のDNA複製開始制御機構の理解に役立であろうと考えている。

E. coli hosts replicate at intervals between 1 and 2 chromosomes, maintaining stability, and replicating at specific times in the cell cycle. These regulatory factors are known as replication initiation proteins (RepE), incC domains, and unknown negative regulatory factors. The next step of the repE gene is to establish a domain in which there are 5 elements present. The number of people in the field is increasing, and the number of people in the field is increasing This domain is also referred to as Incompatibility. IncC domain is a domain of DNA replication, polysomy, and DNA replication initiation. This domain is important for the control of DNA replication. The details of the resistance mechanism are now available. The PCR method was used to determine the location of the differences between the two groups (1). The research plan No. 2 is to combine the different technologies and technologies in different IncC fields. The increase of intracellular RepE concentration in vivo was related to the change of the number of RepE in vivo (Study 4). The research plan is to determine the number of wild type IncC fields, different IncC fields, and different IncC fields. The results show that the formation of RepE-RepE complex is necessary, and the interaction between OR2-RepE and OR3-RepE is important.つまり、ミニFのコピー数调节机构はTitration Modelでは说明できないことがわかった。Now, P1, PK2, R6K copy regulation mechanism is related to the Hand Cuffing Model. In the case of F, the possibility of new copy regulation mechanism is included in the analysis. The results of the experiments on the combination of direct IncC domain, RepE and ORI with electron micromirrors (joint research by Mr. Hirokawa, Ueji) The results of F system are similar to those of F system, and similar to those of F system, and similar to those of F system.

项目成果

Y.Yamamoto, et al: "Construction of a contiguous 874-kb sequence of the Esherichia coli K-12 Genome Corresponding to the 50.0-68.8 min on the linkage map and analysis of its sequence" DNA Research. 4. 169-178 (1997)

Y.Yamamoto 等人：“构建对应于连锁图上 50.0-68.8 分钟的大肠杆菌 K-12 基因组连续 874-kb 序列及其序列分析”DNA Research。

F.Matsunaga, et al.: "The central region of RepE initiator protein of mini-F plasmid.plays a crucial role in dimerization required for negative replication conrrol." J.Mal.Biol. 274. 27-38 (1997)

F.Matsunaga 等人：“迷你 F 质粒的 RepE 起始蛋白的中心区域在负复制控制所需的二聚化中发挥着至关重要的作用。”