アプタマー修飾カンチレバーによる生体分子モニタリング

使用适配体修饰的悬臂进行生物分子监测

• 批准号: 19021017
• 负责人: 荻野 千秋
• 金额: $ 3.2万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021017/
• 关键词: DNAアプタマー; アミノ酸; 原子間力顕微鏡; 80H-dG

【緒言】従来、DNAアプタマーを得るためには、試験管内で、ランダム配列を持つDNA群から親和性クロマトグラフィーの原理を用いて選抜するSELEX法という手法が用いられている。しかし、この手法では、標的分子と、得られたアプタマーの結合力、及び結合特異性を操作することは難しい。そこで我々は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いた、DNAアプタマーの新規SELEX法を提案した。【実験方法】60塩基のランダム配列を持つDNA群を、ビオチン化プライマーを用いたPCRによりビオチン化した。金板にアビジンを固定化した後、ビオチン-アビジン結合を介して一本鎖DNA群を固定化した。本研究で標的分子としているアミノ酸のL-ロイシンをカンチレバーに固定化する。L-メチオニンを含むBinding buffer中で一本鎖DNAを固定化した金板上を走査する。このとき、一本鎖DNAとL-ロイシンとの間で結合が起こり、さらにこの結合力がビオチン-アビジン結合の結合力を上回れば、ビオチン-アビジン結合が切断され、カンチレバー上に一本鎖DNAが残る。この一本鎖DNAを溶出し、PCRにより増幅する。これらの操作を1回の選抜ラウンドとし、これを繰り返すことにより、L-ロイシンに高い特異性と結合力を有するアプタマーを選抜した。【結果と考察】セレクションのラウンド3まで行った結果、ラウンドを進めるのに従って、それぞれラウンドのL-ロイシンと一本鎖DNA間の平均結合力が増加していった。このことから、L-ロイシンに対してのアプタマーが選抜されていると考えられる。また、得られたアプタマーの配列および、二次構造を解析したところ、構造中にアプタマー内の構造として代表的なループ構造を有していることが確認された。

従 to exordium 】 【, DNA ア プ タ マ ー を have る た め に は, test tube で, ラ ン ダ ム を hold つ DNA with column group of か ら affinity ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の principle を with い て choose sorting す る SELEX method と い う gimmick が with い ら れ て い る. し か し, こ の gimmick で は, the underlying molecular と, ら れ た ア プ タ マ ー の adhesion and び specificity を operation す る こ と は difficult し い. そ こ で I 々 は, interatomic force 顕 micro mirror (AFM) を い た, DNA ア プ タ マ ー の new rules SELEX method proposed を し た. 】 【 be 験 method 60 salt base の ラ ン ダ ム match column を hold を つ DNA group, ビ オ チ ン change プ ラ イ マ ー を with い た PCR に よ り ビ オ チ ン change し た. Gold plate に ア ビ ジ ン を immobilized し た, ビ オ チ ン - ア ビ ジ ン combining を interface し て a lock group を DNA immobilized し た. This study で target molecules と し て い る ア ミ ノ acid の L - ロ イ シ ン を カ ン チ レ バ ー に immobilized す る. L - メ チ オ ニ ン を containing む Binding buffer で a lock を DNA immobilized し た gold plate を walkthrough す る. こ の と き, a lock DNA と L - ロ イ シ ン と の で combination between が up こ り, さ ら に こ の binding force が ビ オ チ ン - ア ビ ジ ン combining の binding force を last れ ば, ビ オ チ ン - ア ビ ジ ン combining が cut さ れ, カ ン チ レ バ ー に on DNA が residual る a lock. <s:1> a copy of the lock DNAを dissolves によ, and PCRによ によ によ increases する. こ れ ら の を 1 back to choose の sorting operation ラ ウ ン ド と し, こ れ を Qiao り return す こ と に よ り, L - ロ イ シ ン に high い specificity と binding force を す る ア プ タ マ ー を choose sorting し た. セ results と investigation 】 【 レ ク シ ョ ン の ラ ウ ン ド 3 ま で line っ た results, ラ ウ ン ド を into め る の に 従 っ て, そ れ ぞ れ ラ ウ ン ド の L - ロ イ シ ン と a lock の average between DNA binding force が raised し て い っ た. こ の こ と か ら, L - ロ イ シ ン に し seaborne て の ア プ タ マ ー が optional sorting さ れ て い る と exam え ら れ る. ま た, ら れ た ア プ タ マ ー の match column お よ び, secondary structure analytical し を た と こ ろ, structure of に ア プ タ マ ー の structure within と し て represent な ル ー プ a し を construction て い る こ と が confirm さ れ た.

项目成果

New SELEX strategy for screening of DNA aptamer by AFM

• DOI: 10.1016/j.jbiosc.2009.08.189
• 发表时间: 2009-11
• 期刊: Journal of Bioscience and Bioengineering
• 影响因子: 2.8
• 作者: Y. Miyachi;N. Shimizu;C. Ogino;A. Kondo

Characterization of yeast cell surface displayed Aspergillus oryzae beta-glucosidase 1 high hydrolytic activity for soybean isoflavone

酵母细胞表面表征显示米曲霉 β-葡萄糖苷酶 1 对大豆异黄酮具有高水解活性

• 期刊: J. Mol. Cat. B (in press)
• 作者: J. Ito;H. Sahara;M. Kaya;Y. Hata;S. Shibasaki;K. Kawata;S. Ishida;C. Ogino;H. Fukuda;A. Kondo
• 通讯作者: A. Kondo

原子間力顕微鏡を用いた機能性核酸分子・アプタマーの新規選抜法の開発

利用原子力显微镜开发功能性核酸分子和适体的新选择方法

• 发表时间: 2009
• 作者: 早瀬太治;荻野千秋;宮地佑典;福田秀樹;近藤昭彦
• 通讯作者: 近藤昭彦

原子間力顕微鏡を用いた酵母活性の制御

使用原子力显微镜控制酵母活性

• 发表时间: 2009
• 作者: 野坂和輝;荻野千秋;石井純;宮地佑典;福田秀樹;近藤昭彦
• 通讯作者: 近藤昭彦

Isoflavone aglycones production from isoflavone glycosides by display of beta- -glucosidase from Aspergillus oryzae on yeast cell surface

通过在酵母细胞表面展示来自米曲霉的 β-β-葡萄糖苷酶，从异黄酮糖苷生产异黄酮苷元

• 期刊: Appl. Microbiol. Biotechnol. (in press)
• 作者: M. Kaya;J. Ito;A. Kotaka;K. Matsumura;H. Bando;H. Sahara;C. Ogino;S. Shibasaki;K. Kuroda;M. Ueda;A. Kondo;Y. Hata
• 通讯作者: Y. Hata