テーパー状流路を用いた単一細胞からの瞬間RNA抽出と解析研究

使用锥形通道从单细胞中即时提取 RNA 并进行分析研究

基本信息

批准号：
19021018
负责人：
高村禅
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度得られた成果を列挙する。1. RNA抽出条件の精査と品質の確認これまでの研究で開発した変性剤を用いたトラップ抽出法でも、PCR可能なことが確認されたが、本年度はさらに品質を上げるため、変性剤を用いない方法の開発を試みた。その結果、一旦70℃以上にサンプルを過熱し、一旦熱変性させ、その後常温で速やかにトラップすることで、十分なトラップが可能な条件が見つかった。本法は、変性剤を用いないため、後処理に対する影響が少なく、より適しているとがえれる。2. 単一細胞よりRNAを瞬間抽出し、解析部に確実に渡すためのチップ開発本年度は、特定の検出方法に特化した、チップの設計・最適化を行う。現在、パフォーマンス上のボトルネックとして、単一細胞をチップ内に導入する工程である。したがってここを改善するため、複数の細胞をが含まれている液より、単一細胞を自動的にピックアップし、それぞれの解析流路に一つずつ導入する、微小流体デバイスを開発した。これは、本法以外にも、単一細胞の解析、特に再生医療等での利用が期待されている。3. RNA解析方法の開発3-1 チップ内集積化可能な簡易解析方法の開発昨年度開発したチップ上にミネラルオイルを保持する方法をさらに発展させ、ミネラルオイルを用いない方法の開発に取り組む。具体的には、チップ内部の、水上気圧を制御し、かつガスを投下しにくい膜をチップ内にコーティングする手法を検討する。ミネラルオイルを用いずとも、蒸発が抑えられることを確認した。3-2 チップ外の装置を組み合わせたより高度な解析法の開発チップ内で抽出したRNAをゲル内に保持し、外へ取り出す手法により、定量的な評価を行った。

今年获得的结果如下列出。 1。对RNA提取条件的检查和质量的确认，尽管可以通过使用先前研究中开发的变性剂来确认PCR可以实现PCR，但今年我们试图开发一种不使用变性剂以进一步提高质量的方法。结果，样品一次过热至70°C，然后加热到高于该温度，然后在室温下迅速被困在室温下，并发现了允许足够诱捕的条件。由于此方法不使用修饰符，因此被认为更合适，因为它对后处理几乎没有影响。 2。开发芯片以立即从单个单元中提取RNA并确保今年将其传递给分析单元，我们将设计和优化芯片，专门研究特定检测方法。当前，性能瓶颈是将单个单元引入芯片的过程。因此，为了改善这一点，我们开发了一种微流体设备，该设备会自动从包含多个细胞的液体中拾取单个单元，并将其一个一个一个一个一个一个一个引入每个分析通道中。除此方法外，预计该方法将用于单个细胞的分析，尤其是在再生医学中。 3。RNA分析方法的开发3-1开发了可以集成在芯片中的简单分析方法的开发，我们将进一步开发一种在去年开发的芯片上持有矿物油的方法，并致力于开发一种不使用矿物油的方法。具体而言，一种将芯片内部涂层的方法与控制芯片内的水压且难以降低气体的膜。可以证实，如果不使用矿物油，就可以抑制蒸发。 3-2开发一种更高级的分析方法，将芯片之外的设备结合在一起。定量评估是通过将提取的RNA固定在凝胶中并将其除去的。