テーパー状流路を用いた単一細胞からの瞬間RNA抽出研究

使用锥形通道从单细胞中进行即时 RNA 提取研究

基本信息

批准号：
18038019
负责人：
高村禅
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、幅数ミクロンのテーパー状流路に、圧力と電圧を同時に印加して生体物質を流すと、DNA等長鎖状の分子を選択的にトラップ・抽出・濃縮できる技術を用い、1細胞からmRNAを抽出・精製するチップの開発を目的とする。本年度の成果を列挙する。1.RNA抽出条件の精査RNAはDNAと違い、まずsingle strandであり、自己会合しやすく、また鎖長も様々であるため、DNAトラップのノウハウがそのまま利用できないと考えられる。そこで、本課題では、まず、RNAを選択的にトラップできる条件を探る。具体的には、流路大きさ、圧力、電圧、ランニングバッファー、変性剤の有無、mRNA標識剤の有無などを調べた。その結果、なによりもランニングバッファーの影響が大きいことが分かり、この組成、調整方法を精査した。最終的には、マイルドに変性させる条件下で、効率よく、RNAをトラップできるランニングバッファーが得られ、特許化を行った。これにより、20〜100塩基程度のRNAがトラップできた。これはDNAトラップをもしのぐ成果であり、近年注目されているRNA干渉などの実験への応用も十分期待できるレベルである。2.単一細胞よりRNAを抽出するチップの設計検討実際に1細胞のRNAを瞬間的に抽出可能な、次に挙げる部位より構成されるチップの作製を目指し、本年度は詳細の検討、及び抽出部の試作を行う。2-1 1細胞供給部位一細胞を抽出部位に供給する 2-2 細胞破砕部流路を通る一つの細胞に、適確な濃度の細胞破砕液を作用させ、細胞を破砕すると同時に酵素を破壊する。2-3 RNAトラップ＆捕集部テーパー状流路を用いて、RNAのみを選択的に捕集し、別流路に精製・分岐する。以上の各ステップを別々にチップ化し、具体的に検討をおこなった。その結果、ほぼ当初の予定通りの成果を得ることができた。

这项研究的目的是使用一种技术，可以使用一种技术来开发从一个细胞中提取和净化mRNA的芯片，该技术可以选择性捕获，提取和富集长链分子（例如DNA）（例如DNA），例如同时将压力和电压施加到具有几微米宽度的锥形流动路径上。这是今年的结果。 1。与DNA不同，RNA提取条件首先是单链，它们易于自我结合并且具有多种链长度，因此人们认为DNA陷阱的知识不能像IS一样使用。因此，在此任务中，我们首先探索选择性捕获RNA的条件。具体而言，检查了流动路径大小，压力，电压，运行缓冲液，修饰符的存在或不存在以及mRNA标记剂的存在或不存在。结果，发现运行缓冲区的影响很大，并且仔细检查了这种组成和调整方法。最终，在轻度贬低条件下有效地捕获RNA的运行缓冲液获得了专利。这允许将大约20至100个碱基的RNA捕获。这是一项超过DNA陷阱的成就，高度预期将应用于RNA干扰等实验，近年来一直引起人们的注意。 2。芯片设计以从单个单元中提取RNA，我们将在今年进行详细的检查和原型提取部分，旨在创建一个芯片，实际上可以立即从一个单元中提取RNA，由一个由以下位点组成。 2-1一个细胞供应位点向萃取位点供应一个细胞2-2细胞破坏部分A适当浓度的细胞裂解物应用于通过流动路径的细胞，从而导致细胞弯曲并同时破坏酶。 2-3 RNA陷阱和收集零件仅使用锥形流道选择性地收集RNA，并将其纯化并分支为单独的流道。上述每个步骤分别转换为芯片，并进行了具体考虑。结果，我们能够达到最初计划的计划。