非侵襲的細胞脂質解析を目指した生体触媒モジュールの開発

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脂質・脂肪酸分子種の網羅的解析技術の開発は、その生命活動における重要性にも関わらず、他の分子種に比べ遅れている。将来的に、細胞非侵襲的かつ連続的な時系列での分析を可能とするためには、新たな手法の開発が必要である。生体触媒モジュール(酵素)を用いる分析法は、その基盤技術になると考える。本研究では、脂質・脂肪酸分子種の酵素分析法として、1) 脂質クラス特異的脂肪酸遊離酵素(リパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコリパーゼ、セラミダーゼ等)による遊離脂肪酸の生成、2) 遊離脂肪酸のシトクロームP450による分子種分別、3) シトクロームP450反応生成物(過酸化物)のペルオキシダーゼ反応によるモニタリング、の3ステップにより構成される系の構築を試みた。本年度は、本分析系においてセンシングの要となるシトクロームP450の開発に関して、前年度に、引き続き、脂肪酸水酸化酵素であるBacillus megaterium由来シトクロームP450 BM-3の変異型酵素ライブラリーの作成、ならびに、様々な変異型酵素・基質の組み合わせについてペルオキシダーゼとのカップリングによる脂肪酸の検出を試みた。その結果、明瞭な差異ではないものの、脂肪酸鎖長や不飽和度の違いをモニターしうる変異型酵素群の作成を達成した。また、その過程で、スーパーオキシドジスムターゼによるP450 BM-3の活性化/安定化現象を見いだした。この活性化/安定化は、スーパーオキシドジスムターゼの触媒機能に起因していたため、活性酸素消去がP450 BM-3の活性化/安定化に有効であることが示唆され、スーパーオキシドジスムターゼのP450 BM-3変異型酵素群による脂肪酸センシングの活性化/安定化への応用が期待された。