時空間相互相関法を用いた細胞核内ダイナミクスの解析

使用时空互相关方法分析细胞内动力学

• 批准号: 19038001
• 负责人: 金城 政孝
• 金额: $ 5.7万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19038001/
• 关键词: 生物物理; 細胞; 蛍光測定; 細胞核; ゆらぎ; 拡散速度; イメージング; 蛍光相関分光法; 核内微環境; 蛍光寿命

注目している生体分子同士や他の生体分子間の相互作用の強さを生きている細胞内で可視化することは、動的な生体機能を可視化することに直結すると考えた。そこで細胞核内の構造を蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)を利用して, 分子運動の特性に注目して解析し, これまでのイメージング手法では明らかにできなかった核の機能と密接関連したダイナミックな機構が存在する事を目指した。しかし, 拡散測定に基礎をおくFCSだけでは分子量比が極端に大きくないと分子間の相互作用が検出できない、また内在性タンパク質の影響が無視できないなどの限界があり, それを乗り越えるために一分子蛍光強度と新たに空間相互相関測定を利用してこれまでの研究をさらに発展させていくことを計画した。そのためにまず走査型2点測定FCS装置の試作と細胞内相互作用測定法を確立した。次に具体的なターゲットとしてGlucocorticoid Receptor(GR)に注目した。我々のこれまでのFCS測定の結果、核内でGRが二量体化することで転写調節が開始されるという機構を示唆しているが、細胞のどこで(空間)、何時(時間)2量化するかは不明のままである。その解明のため、まずFCS時間相関解析における蛍光寿命解析による2量体補正を完成させることを目指した。これまでさまざまなリンカー長を有する約20種類のGFP2量体を作成し, その長さとFCSにおける一分子蛍光強度との関係を明らかにした。リンカー長が短くなるとホモFRETがおきるために蛍光寿命が短くなり, それに伴い蛍光強度も小さくなり, FCSにおける一分子あたりの蛍光強度も低下した。しかし, ある長さ以下の組み合わせでは蛍光強度が回復するところがあり, そのリンカー配列以降で構造変化が示唆され, その部分までがFCSにおける2量体測定の定量的な測定が可能であることが分かった。今後, FCSの一分子蛍光強度を指標にして細胞質ならびに核内におけるGR2量体形成量の詳細な解析を目指す予定である。

Attention し て い る raw body molecules with や his の raw body strong intermolecular interaction の の さ を raw き て い る intracellular で visualization す る こ と は, dynamic born な body function を visualization す る こ と に straight knot す る と exam え た. Youdaoplaceholder0 で で nuclear <s:1> structure を蛍 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)を Utilizing <s:1> て, molecular motion <s:1> characteristics に focus on て analysis of て こ れ ま で の イ メ ー ジ ン グ gimmick で は Ming ら か に で き な か っ た nuclear の function と contact masato even し た ダ イ ナ ミ ッ ク な institutions が す る matter を refers し た. Based を し か し, company determine に お く FCS だ け で は molecular weight is bigger than が extreme に き く な い と の interactions between molecules が 検 out で き な い, ま た internality タ ン パ ク qualitative の influence が ignore で き な い な ど の limit が あ り, そ れ を 乗 り more え る た め に new molecular 蛍 light intensity と た に space each phase masato を using し て こ れ ま で の research を さ ら に 発 exhibition さ せ て い く こ と を project し た. Youdaoplaceholder0 ためにまず ためにまず the two-point FCS device of the walking test type を the と intracellular interaction assay を was established た. Next, に specific なタ ゲットと ゲットと て てGlucocorticoid Receptor(GR)に pay attention to た た. I 々 の こ れ ま で の FCS の results, nuclear で GR が 2 quantity body change す る こ と で planning adjustment が began さ れ る と い う institutions を in stopping し て い る が, cell の ど こ で (space), when (time) 2 quantitative す る か は unknown の ま ま で あ る. そ の interpret の た め, ま ず FCS time phase analytical に masato お け る 蛍 light life parsing に よ る 2 quantity body corrected を complete さ せ る こ と を refers し た. こ れ ま で さ ま ざ ま な リ ン カ ー を have long す る about 20 kinds の GFP2 quantity body を し consummate, そ の long さ と FCS に お け る a molecular 蛍 light intensity と の masato を and Ming ら か に し た. リ ン カ ー long が short く な る と ホ モ FRET が お き る た め に 蛍 light life short が く な り, そ れ に with い 蛍 light intensity も small さ く な り, FCS に お け る a molecular あ た り の 蛍 low light intensity も し た. し か し, あ る の group under long さ み close わ せ で は 蛍 light intensity が reply す る と こ ろ が あ り, そ の リ ン カ ー go to drop で structure - が in stopping さ れ, そ の part ま で が FCS に お け る 2 quantity body may determine the な の quantitative determination of が で あ る こ と が points か っ た. の molecular 蛍 light intensity in the future, the FCS を index に し て cytoplasm な ら び に intranuclear に お け る GR2 quantity body formation quantity の detailed analytical を な refers す designated で あ る.

项目成果

Dissociation of the insulin receptor and caveolin-1 complex by ganglioside GM3 in the state of insulin resistance

• DOI: 10.1073/pnas.0703650104
• 发表时间: 2007-08-21
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Kabayama, Kazuya;Sato, Takashige;Inokuchi, Jin-ichi
• 通讯作者: Inokuchi, Jin-ichi

Diffusion analysis of glucocorticoid receptor and antagonist effect in living cell nucleus

• DOI: 10.1016/j.yexmp.2006.12.001
• 发表时间: 2007-04-01
• 期刊: EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY
• 影响因子: 3.6
• 作者: Mikuni, Shintaro;Pack, Changi;Kinjo, Masataka
• 通讯作者: Kinjo, Masataka

Detection of polyglutamine protein oligomers in cells by fluorescence correlation spectroscopy.

通过荧光相关光谱法检测细胞中的聚谷氨酰胺蛋白寡聚物。

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Biol Chem 282
• 作者: Takahashi Y;Okamoto Y;Popiel HA;Fujikake N;Toda T;Kinjo M;Nagai Y.
• 通讯作者: Nagai Y.

Effect of cholesterol on diffusion in surfactant bilayers

胆固醇对表面活性剂双层扩散的影响

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Chem Phys 127(16)
• 作者: Pieper T;Markova S;Kinjo M;Suter D
• 通讯作者: Suter D

動物実験代替のためのバイオマテリアル・デバイス

生物材料装置替代动物实验

• 发表时间: 2007
• 作者: Hiroki Yokoyama;Hiromichi Nakahara;Osamu Shibata;F.Nishimura;梶弘和
• 通讯作者: 梶弘和