多点時空間相関解析法による細胞内分子複合体研究

利用多点时空相关分析方法研究细胞内分子复合物

• 批准号: 21221006
• 负责人: 金城 政孝
• 金额: $ 113.07万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009-05-11 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21221006/
• 关键词: 1分子計測; 可視化; 生物物理; 細胞・組織; シグナル伝達; 時間相関; 空間相関; 空間光位相変調

蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS）はダイナミックな分子間相互作用を単一分子レベルで解析する手法でるが、その一方で、励起光源にレーザー光が必要であり、その焦点領域である、特定の１点でしか測定出来ない。このことは生細胞が様々な区画に分かれていて、さらにその区画の中も不均一であるため、細胞生物学的応用の際の問題となっている。その解決のために本年も引き続き多点同時測定FCSの構築と生細胞測定への応用を目指ざしている。そこでこれまで多点測定のためのまず、多点の焦点領域を作る必要がある。そのために空間光変調素子を利用したホログラフィ技術により複数照射の励起光パターンを作りだすことを可能とした。次に検出側としてマルチ光ファイバーと各端面に光電子増倍管を接続した多点検出装置を用いて，実際に生細胞内の多点におけるタンパク質の拡散運動を検出する装置を作成した。次に本年は細胞応用測定に重点を置き、細胞質ならび細胞核を区別して7点同時測定を行った。生細胞内GFPを対象としてガラス面からZ軸方向（上方向）に0.5ミクロンステップの空間分解能があることを証明し、次に細胞核膜を境にして同時7点測定FCS測定が可能であることを実証した。次に機能性タンパク質としてリガンド刺激により、細胞質から核へ移行するグルココルチコイドレセプター（GR）のGFP融合タンパク質を対象とした測定を行い、15秒おきのFCS多点同時測定に成功した。さらに本年は精度を上げるために細胞運動の抑制方法を種々検討し、ノコダゾール処理と、緩衝液を調整することで、長期の観測を可能とした。安定測定が可能となったので、さらに時間分解を上げることが可能となったので、単一タンパク質分子の動態について、検出と解析を試みている。

Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) is a method for analyzing molecular interactions between molecules. It is necessary to excite the light source and determine the focal area and specific point. This is the first time that a cell has ever been used in a cell. This year's multi-point simultaneous determination of FCS and the construction of biological cell assays are indicated. Multi-point measurement and multi-point focus are necessary. The space modulator is used to stimulate light. The multi-point detector is used to detect the multi-point scattering motion in the cell. This year's cell test focuses on the determination of cytoplasm and nucleus. The spatial decomposition of GFP in the cell was demonstrated in the Z-axis direction (upward direction), and the FCS measurement was possible at 7 points. The next step is to measure the functional properties of the protein in the cytoplasm and the nuclear migration in the cytoplasm. The GFP fusion protein in the cytoplasm is measured in 15 seconds and the FCS multi-point simultaneous assay is successful. This year, the accuracy of cell movement inhibition methods is improved, and the buffer solution is adjusted. Stability determination is possible, time decomposition is possible, single molecule dynamics is possible, detection is possible, and resolution is possible.

项目成果

蛍光相関分光法による細胞機能解析

使用荧光相关光谱分析细胞功能

• 发表时间: 2011
• 作者: 森元雄大;後藤雄治;高橋則雄;金城政孝
• 通讯作者: 金城政孝

Dynamic assembly properties of nonmuscle myosin II isoforms revealed by combination of fluorescence correlation spectroscopy and fluorescence cross-correlation spectroscopy

• DOI: 10.1093/jb/mvq134
• 发表时间: 2011-03-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.7
• 作者: Mitsuhashi, Mariko;Sakata, Hiroshi;Takahashi, Masayuki
• 通讯作者: Takahashi, Masayuki

Atg9 vesicles are an important membrane source during early steps of autophagosome formation.

• DOI: 10.1083/jcb.201202061
• 发表时间: 2012-07-23
• 期刊: The Journal of cell biology
• 作者: Yamamoto H;Kakuta S;Watanabe TM;Kitamura A;Sekito T;Kondo-Kakuta C;Ichikawa R;Kinjo M;Ohsumi Y
• 通讯作者: Ohsumi Y

Imaging correlation analysis of intranuclear transcriptional activity of glucocorticoid receptor

糖皮质激素受体核内转录活性的影像相关性分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 大島千佳;中山功一;安田清;伊藤直樹;西本一志;細井尚人;奥村浩;Shintaro Mikuni
• 通讯作者: Shintaro Mikuni

Current Research on Protein-Protein Interactions Among Auxin-Singnaling Factors in Regulation of Plant Grouwth and Development

植物生长发育调控中生长素信号因子间蛋白质-蛋白质相互作用的研究现状

• 发表时间: 2011
• 期刊: Curr Pharm Biotechnol
• 作者: 岡村脩平;笹山瑛由;高橋則雄;山上美浩;Muto H.
• 通讯作者: Muto H.