液胞型ATP合成酵素のATP合成反応の解析

液泡 ATP 合酶的 ATP 合成反应分析

基本信息

批准号：
19042008
负责人：
横山謙
金额：
$ 3.97万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042008/
关键词：
V-ATPase ATP 分子モーター生体エネルギー代謝 ATP合成回転

项目摘要

好熱菌Thermus thermophilus由来のV-ATPaseのATP合成反応を測定した。V-ATPaseの精製過程で複数の膜タンパク質が副産物として精製されてきたが、そのうちの一つである硫化水素の代謝に関係するPolysufide Reductaseの結晶構造を解明することができた。プロトン駆動力の負荷はacid-base transition法により行った。酸性緩衝液にV-ATPaseを再構成したリポソームを浸した後、塩基性の緩衝液に入れることによりpH濃度勾配(ΔpH)を負荷する。バリノマイシン存在下でリポソーム内外のカリウムイオン濃度勾配をつけることにより膜電位(Δφ)を負荷した。V-ATPaseにより合成されたATPは、ルシフェリンルシフェラーゼ系による燐光の測定により検出した。この方法により、リアルタイムATP合成活性測定が可能になった。ATP合成活性は、リポソームの作成法や酸性化に使うbufferの種類等に依存した。酸性化bufferに2塩基酸であるコハク酸やマロン酸を使用し、ΔpH=3.3, Δφ=118mVのプロトン駆動力を負荷した場合のATP合成活性は〜80sec^<-1>であった。1塩基酸であるMESを酸性化bufferに使用したときの活性値〜60sec^<-1>よりも高い。2塩基酸の膜間移動による膜電位発生によるとがえられる。膜電位の見積もりを正確にするために以後の実験には、MESを酸性化bufferとして使用した。膜電位が負荷されていない条件でもΔpH=>2.0で合成活性がみられ、ΔpHの上昇にともないATP合成活性も増加した。また、ΔpH=3の条件でΔφを負荷した場合、Δφの上昇に応じてATP合成活性も増加した。以上の結果からΔpHのみでもATPは合成され、ΔpHとΔφがATP合成活性に対して加算的に働くことが示された。次に反応液中のATP/ADP比が異なる場合でのATP合成活性を測定した。ATP合成に必要なプロトン駆動力(ΔpH+Δφ)の閾値を求め、ATP1分子の合成に必要なプロトン透過数(H+/ATP比)4.0±0.1が算出された。

测量了嗜热细菌嗜热细菌的V-ATPase的ATP合成反应。在V-ATPase的纯化过程中，多种膜蛋白已被纯化为副产品，并且有可能阐明多肽还原酶的晶体结构，该晶体结构与硫化氢的代谢有关，其中一种已被阐明。质子驱动力的加载是通过酸碱过渡方法进行的。浸入用V-ATPase重构的脂质体在酸性缓冲液中重构后，通过将它们放在基本的缓冲液中来加载pH浓度梯度（ΔPH）。膜电位（Δφ）在脂质体的存在下通过脂质体内外的钾离子浓度梯度加载。使用荧光素荧光素酶系统通过磷光测量检测到通过V-ATPase合成的ATP。该方法使测量实时ATP合成活性成为可能。 ATP合成活性取决于脂质体产生方法和用于酸化的缓冲液类型。当使用两个碱性酸琥珀酸或恶酸制成酸化的缓冲液，而ΔPH= 3.3和Δφ= 118MV的质子驱动力时，ATP合成活性约为80 sec^<-1>。当使用单个基酸的Mes用于酸化缓冲液时，活性值约为60 sec^<-1>。据说这是由于两个基酸的膜间转移引起的膜电位引起的。在随后的实验中，将ME用作酸化缓冲液，以准确估计膜电位。即使在没有膜电位的条件下，在ΔPH=> 2.0时也观察到合成活性，而ATP合成活性也随着ΔPH的增加而增加。此外，当在Δph= 3的条件下加载Δφ时，ATP合成活性也随着Δφ的增加而增加。以上结果表明，ATP仅在ΔPH下合成，除了ATP合成活性外，ΔPH和Δφ也起作用。接下来，当反应溶液中的ATP/ADP比不同时，测量了ATP合成活性。确定了ATP合成所需的质子驱动力的阈值（ΔPH+Δφ），并计算了合成ATP1分子所需的质子传输数量（H+/ATP比）。

项目成果

期刊论文数量（4）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Dodecamer rotor ring defines H^+/ATP synthesis of prokaryotic V-ATPase from Thermus thermophilus

十二聚体转子环定义了来自嗜热栖热菌的原核V-ATP酶的H^/ATP合成

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103
影响因子：
0
作者：
Toei;H.;Gerle;C.;Nakano;N.;Tani;K.;Gyobu;N.;Tamakoshi;M.;Nobuhito Sone;N.;Yoshida;M.;Fujiyoshi;Y.;*Mitsuoka;K.;Yokoyama;K
通讯作者：
K

V-ATPaseのATP合成反応の解析

V-ATP酶的ATP合成反应分析

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
Murayama A;他;横山謙
通讯作者：
横山謙

ATP hydrolysis and synthesis of a rotary motor V-ATPases from Thermus thermophilus

嗜热栖热菌旋转马达 V-ATP 酶的 ATP 水解和合成

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
The Journal of Biological Chemistry 283(In press)
影响因子：
0
作者：
Masahiro Nakano;Hiromi Imamura;Masashi Toei;Masatada Tamakoshi;Masasuke Yoshida;and Ken Yokoyama
通讯作者：
and Ken Yokoyama