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液胞型ATP合成酵素のATP合成反応の解析

液泡 ATP 合酶的 ATP 合成反应分析

基本信息

批准号：
19042008
负责人：
横山謙
金额：
$ 3.97万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042008/
关键词：
V-ATPase ATP 分子モーター生体エネルギー代謝 ATP合成回転

项目摘要

好熱菌Thermus thermophilus由来のV-ATPaseのATP合成反応を測定した。V-ATPaseの精製過程で複数の膜タンパク質が副産物として精製されてきたが、そのうちの一つである硫化水素の代謝に関係するPolysufide Reductaseの結晶構造を解明することができた。プロトン駆動力の負荷はacid-base transition法により行った。酸性緩衝液にV-ATPaseを再構成したリポソームを浸した後、塩基性の緩衝液に入れることによりpH濃度勾配(ΔpH)を負荷する。バリノマイシン存在下でリポソーム内外のカリウムイオン濃度勾配をつけることにより膜電位(Δφ)を負荷した。V-ATPaseにより合成されたATPは、ルシフェリンルシフェラーゼ系による燐光の測定により検出した。この方法により、リアルタイムATP合成活性測定が可能になった。ATP合成活性は、リポソームの作成法や酸性化に使うbufferの種類等に依存した。酸性化bufferに2塩基酸であるコハク酸やマロン酸を使用し、ΔpH=3.3, Δφ=118mVのプロトン駆動力を負荷した場合のATP合成活性は〜80sec^<-1>であった。1塩基酸であるMESを酸性化bufferに使用したときの活性値〜60sec^<-1>よりも高い。2塩基酸の膜間移動による膜電位発生によるとがえられる。膜電位の見積もりを正確にするために以後の実験には、MESを酸性化bufferとして使用した。膜電位が負荷されていない条件でもΔpH=>2.0で合成活性がみられ、ΔpHの上昇にともないATP合成活性も増加した。また、ΔpH=3の条件でΔφを負荷した場合、Δφの上昇に応じてATP合成活性も増加した。以上の結果からΔpHのみでもATPは合成され、ΔpHとΔφがATP合成活性に対して加算的に働くことが示された。次に反応液中のATP/ADP比が異なる場合でのATP合成活性を測定した。ATP合成に必要なプロトン駆動力(ΔpH+Δφ)の閾値を求め、ATP1分子の合成に必要なプロトン透過数(H+/ATP比)4.0±0.1が算出された。

Determination of ATP synthesis in V-ATPase from Thermus thermophilus V-ATPase purification process is a complex of membrane components by-products, purification process, a series of processes, the relationship between sulfide metabolism and the crystal structure of polysulfide Reductase is explained. The acid-base transition method is used to analyze the dynamic load of the engine. V-ATPase reconstitution in acidic buffer solution, pH concentration adjustment (ΔpH) loading in basic buffer solution The membrane potential (Δφ) is loaded in the presence of the membrane. V-ATPase synthesis and determination of phosphorescence This method allows for the determination of ATP synthesis activity. ATP synthesis activity depends on the preparation method of ATP and the type of ATP buffer. The ATP synthesis activity of acidic buffer for 2-amino acids was ~ 80sec when pH=3.3, Δφ=118mV and power load was applied<-1>. 1. Alkyl acid is used as an acidic buffer. Activity value is ~ 60sec<-1>. 2. The membrane potential of the base acid is generated by the intermembrane migration. The membrane potential is measured correctly, and then the MES is acidified. The membrane potential is loaded with pH>2.0, the synthesis activity is increased, and the ATP synthesis activity is increased. Under the condition of ΔpH=3, Δφ increases with increasing ATP synthesis activity. The above results show that ΔpH and Δφ increase ATP synthesis activity. ATP synthesis activity was measured when ATP/ADP ratio in the secondary reaction solution was different. The threshold value for ATP synthesis was calculated. The transmission number (H+/ATP ratio) for ATP synthesis was calculated as 4.0±0.1.

项目成果

期刊论文数量（4）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Dodecamer rotor ring defines H^+/ATP synthesis of prokaryotic V-ATPase from Thermus thermophilus

十二聚体转子环定义了来自嗜热栖热菌的原核V-ATP酶的H^/ATP合成

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103
影响因子：
0
作者：
Toei;H.;Gerle;C.;Nakano;N.;Tani;K.;Gyobu;N.;Tamakoshi;M.;Nobuhito Sone;N.;Yoshida;M.;Fujiyoshi;Y.;*Mitsuoka;K.;Yokoyama;K
通讯作者：
K

V-ATPaseのATP合成反応の解析

V-ATP酶的ATP合成反应分析

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
Murayama A;他;横山謙
通讯作者：
横山謙

ATP hydrolysis and synthesis of a rotary motor V-ATPases from Thermus thermophilus

嗜热栖热菌旋转马达 V-ATP 酶的 ATP 水解和合成

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
The Journal of Biological Chemistry 283(In press)
影响因子：
0
作者：
Masahiro Nakano;Hiromi Imamura;Masashi Toei;Masatada Tamakoshi;Masasuke Yoshida;and Ken Yokoyama
通讯作者：
and Ken Yokoyama

Molecular mechanism of energy conservation in polysulfide respiration.