マイクロチャンバーによるABCトランスポーター基質測定系の開発

使用微室开发 ABC 转运蛋白底物测量系统

• 批准号: 18657041
• 负责人: 横山 謙
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18657041/
• 关键词: トランスポーター; 微細加工; 計測技術; 基質輸送; ABCトランスポーター

本研究の目標は、微細加工技術(MEMS)で作成したマイクロチャンバー上の人工膜にABCトランスポーターを再構成し、その輸送活性をリアルタイムで測定する系を確立することである。本研究では、ABCトランスポーターを平面膜に組み込む必要があるが、好熱菌のABCトランスポーターの大腸菌を宿主とした発現系の構築が必要である。先年度においてATPase活性を保持したヘテロオリゴマータイプのABCトランスポーターの発現および平面膜への膜タンパク質であるV-ATPaseの再構成の確認には成功している。ABCトランスポーターの平面膜への再構成効率を評価するために、蛍光色素を導入した。蛍光色素ラベルによりABCトランスポーターのATPase活性が消失することはなかった。1分子蛍光観察により平面膜への組み込みを調べた。効率は悪いものの、平面膜上に タンパク質由来のものと思われる輝点を多数確認した。蛍光を持つ輸送基質の取り込みをATP存在下で調べているが、背景に比べて明確なチャンバー内の蛍光強度の増加は確認されていない。その原因の一つとしてチャンバー自体の自然蛍光があり、現在チャンバーの素材の検討を行っている。

这项研究的目的是建立一个系统，该系统将ABC转运蛋白重建为通过微加工技术（MEMS）创建的微型室中的人造膜，并实时测量其运输活性。在这项研究中，有必要将ABC转运蛋白掺入平面膜中，但是有必要用大肠杆菌构建一种用于嗜热ABC转运蛋白的表达系统。在过去的一年中，我们成功证实了杂产ABC转运蛋白的表达，该转运蛋白保留了ATPase活性，并将V-ATPase（一种膜蛋白）的重建源为平面膜。为了评估ABC转运蛋白到平面膜的重建效率，引入了荧光染料。荧光染料标签并未消除ABC转运蛋白的ATPase活性。通过单分子荧光观察研究了掺入平面膜中。尽管效率不足，但平面膜上的许多亮点被认为是蛋白质衍生的。在ATP存在下已经研究了荧光转运底物的摄取，但与背景相比，腔室内荧光强度没有明显增加。原因之一是腔室本身的自然荧光，我们目前正在研究腔室的材料。

项目成果

非侵襲可視化ハンドブック -ナノバイオ・医療から情報システムまで-

非侵入性可视化手册 - 从纳米生物/医学到信息系统 -

• 发表时间: 2007
• 作者: 横山 謙;他
• 通讯作者: 他

Reconstitution in vitro of V1 complex of Thermus thermophilus V-ATPase revealed that ATP binding to the A subunit is crucial for V1 formation

• DOI: 10.1074/jbc.m608253200
• 发表时间: 2006-12-15
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Imamura, Hiromi;Funamoto, Saeko;Yokoyama, Ken
• 通讯作者: Yokoyama, Ken