V型ATP合成酵素の回転の直接観察

直接观察 V 型 ATP 合酶的转换

• 批准号: 10780404
• 负责人: 横山 謙
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780404/
• 关键词: ATP synthase; rotation; V-ATPase; ATP合成酵素; 液胞型ATPase; 分子モーター

吉田らの方法に準拠して、V1-ATPaseの回転の観察を行うために、遺伝子操作によりローターサブユニットである、ガンマsubunitにシステイン残基を導入したmutantV1を合計10種類作成した(ガンマサブユニット2,32,58,90,95,100,116,120,144,163のセリン、 もしくはアラニンをシステインに置換)。蛍光化されたアクチン線維をローターサブユニットに結合させるためには、ガンマのシステイン残基をNEM-ビオチン化する必要がある。作成したmV1うち明確にビオチン化されるのは100番目のものだけであった。現在、このmutantV1を用いて回転の観察をおこなっている。いまのところ、明確な回転を観察できていない。この実験と平行して、ガンマsubnitの回転と共役したc-subunit oligomerの回転の観察も試みている。そのためにVoV1 operonのクローニングを行い、全塩基配列の決定と、構成subunitの決定に成功した(JBC274,inpress,on May)。現在、VoV1の発現系の構築を試みている。

In accordance with the method of Yoshida et al., in order to observe the rotation of V1-ATPase, a total of 10 mutantV1, which was genetically engineered to introduce cysteine ​​residues into the gamma subunit, was created (substitut for serine or alanine of the gamma subunit 2, 32, 58, 90, 95, 100, 116, 120, 144, 163, to observe the V1-ATPase的旋转）。为了将荧光肌动蛋白纤维与转子亚基结合，伽马的半胱氨酸残基必须是二甲基化的。在产生的MV1中，只有第100个显然是生物素化的。当前，使用此mutantV1进行旋转观测。在这一点上，我们无法观察到任何清晰的旋转。与该实验同时，我们还尝试观察与伽马亚尼特旋转相结合的C-亚基低聚物的旋转。为此，将VOV1操纵子克隆到克隆中，并确定整个碱基序列，并确定成分亚基（JBC274，Inpress，5月）。目前，我们正在尝试构建VOV1表达系统。

项目成果

Yokoyama,K., et al.: "V-type ATPase/synthase from Thermus thermophilus"Journal of Biological Chemistry. in press214 May. (2000)

Yokoyama,K.等人：“来自嗜热栖热菌的V型ATP酶/合酶”生物化学杂志。